生物活性代谢物的发现和进化

生物活性代谢物的发现和进化
1.相关申请
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2020年1月8日提交的美国临时申请号62/958,368的权益，其通过引用以其全文并入本文。
3.政府支持
4.本发明是在美国政府资助下由美国国家科学基金会授予1750244号拨款完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
5.本文公开了用于发现和进化代谢途径的系统、方法、试剂、装置、载体和宿主细胞，所述代谢途径产生调节酶功能的小分子。


背景技术：

6.天然产物及其衍生物是药物和药物制剂的长期来源1–3。这些分子——也许是由于它们的生物学来源——往往表现出良好的药理学特性(例如，生物利用度和“代谢物相似性”)
1,4
，并且可以发挥惊人的多种治疗效果(例如，镇痛、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、细胞毒性、免疫抑制和免疫刺激)5–
10
。合成生物学和代谢工程的最新进展为已知的药学相关天然产物的有效生物合成和功能化提供了新方法
11
–
13
；然而，用于发现和优化具有特定治疗相关活性的新产品的补充方法仍需发展
14
。
7.现有的天然产物发现策略在很大程度上是无方向的和/或范围有限的。例如，大型天然产物文库的筛选——有时通过组合(生物)化学
15
–
17
进行增强——发现了具有重要药学特性的分子
18
，但是这些筛选是资源密集型的，并且很大程度上受制于偶然性
19
。相反，生物信息学工具实现鉴定生物合成基因簇
20,21
，其中共同定位的抗性基因(如果存在)可以揭示其产物的生化功能
22
。然而，许多药学相关代谢物的治疗活性与其天然功能不同
23
，并且大多数生物合成途径在适当重新配置时可以产生全新的——也许更有效的——治疗分子
12,24
。
8.微生物系统已成为从不可培养或低产量生物体来生物合成天然产物的强大平台。
25,26
最近的工作表明，此类系统还可以实现发现和进化具有特定治疗相关活性的代谢途径(pct/us2019/40896)。


技术实现要素：

9.本文公开了用于发现和进化产生调节酶功能的小分子的代谢途径的系统、方法、试剂、装置、载体和宿主细胞。例如，提供一种微生物，其中第一基因编码系统将细胞生长与靶酶的活性联系起来，并且其中第二基因编码系统——待发现或进化——产生调节靶酶的活性的代谢物。本公开将这种方法应用于翻译后修饰蛋白质的靶酶的子集，应用于产生苯丙素类或非核糖体肽的代谢途径，以及应用于发现隐蔽的代谢途径。本公开的一些方面提供了产生特定酶活性调节剂、产生此类调节剂的改进滴度(相对于起始途径)和/或表现出
降低的宿主毒性(相对于起始途径)的特定重新配置的或进化的途径。还公开了具有特定抑制作用的代谢产物。
10.根据一方面，提供了用于发现和进化产生调节蛋白质功能的分子的代谢途径的方法。该方法包括使包含目的蛋白质(例如目的酶)的宿主细胞的群体与包含不同代谢途径的表达载体的群体接触，其中该宿主细胞易于转移该表达载体的群体；在该宿主细胞的群体中表达代谢途径，其中当宿主细胞的所述细胞或细胞群内的代谢途径产生调节目的蛋白质(例如目的酶)的产物时，宿主细胞的群体的细胞或子集产生可检测输出；在能够测量宿主细胞的群体的细胞或子集中的可检测输出的条件下筛选宿主细胞的群体；分离产生可检测输出的宿主细胞的群体的细胞或子集；分离在宿主细胞的群体的细胞或子集中产生比携带参考途径的参考载体(例如编码不产生具有足以调节目的蛋白质(例如目的酶)活性的浓度和/或效力的分子的途径的载体)的输出更高(p《0.05)的可检测输出的表达载体；以及对由在宿主细胞的群体的细胞或子集中产生比所述参考载体的输出更高的可检测输出的表达载体编码的代谢途径的产物进行。
11.在一些实施方案中，宿主细胞包含基因编码系统，其中目的蛋白质(例如目的酶)的活性控制蛋白质复合物的组装，并因此产生与形成的复合物的量成比例的可检测输出，该蛋白质复合物的活性是该复合物的两种或更多种组分中的任一种不具有的。
12.在一些实施方案中，目的蛋白质是添加翻译后修饰的酶，该翻译后修饰导致初始解离的两种蛋白质共价连接或形成非共价复合物。
13.在一些实施方案中，复合物由解离常数(kd)小于或等于sh2结构域与其磷酸化底物之间形成的复合物的kd的两种蛋白质形成。
14.在一些实施方案中，目的酶是添加翻译后修饰而不是添加或去除磷酸盐的酶，并且该修饰导致在细胞内初始解离的两种蛋白质共价连接或形成解离常数(kd)小于或等于sh2结构域与磷酸化sh2底物结构域之间形成的复合物的kd的复合物(例如，如图1a所示)。
15.在一些实施方案中，代谢途径产生苯丙素类或非核糖体肽。
16.在一些实施方案中，包含不同代谢途径的表达载体包含通过使起始代谢途径中的一个或多个基因突变而产生的途径文库。
17.在一些实施方案中，代谢途径中的一种或多种包含具有未知生物合成能力的基因的集合。
18.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生与其他代谢途径的产物不同的产物。
19.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生比其他代谢途径产生的产物量更大量的产物。
20.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种表现出比其他代谢途径更低的细胞毒性。
21.在一些实施方案中，代谢途径的产物通过标准分析方法表征，优选地通过气相色谱-质谱(gc/ms)、液相色谱-质谱(lc/ms)和/或核磁共振(nmr)波谱。
22.在一些实施方案中，该方法进一步包括分离产物。
23.在一些实施方案中，该方法进一步包括浓缩产物，优选地使用旋转蒸发仪。
24.在一些实施方案中，该方法进一步包括测试产物对目的蛋白质(例如目的酶)的影
响。
25.在一些实施方案中，目的蛋白质(例如目的酶)是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶或相关的水解酶。
26.在一些实施方案中，提供鉴定的产物或分子(例如，紫穗槐二烯(amorphadiene)及其衍生物、紫杉二烯(taxadiene)及其衍生物、β-红没药烯(β-bisabolene)及其衍生物、α-红没药烯及其衍生物、以及α-长叶蒎烯(α-longipinene)及其衍生物)作为用于治疗ptp导致的疾病(例如，2型糖尿病、her2阳性乳腺癌或rett综合征)的药物或药物先导物，以及作为通过向需要此类治疗的对象施用有效量的该分子来治疗此类疾病的方法。
27.根据另一方面，提供了组合物或系统，其包括包含目的蛋白质的宿主细胞的群体和包含不同代谢途径的表达载体的群体，其中当代谢途径产生调节目的蛋白质的产物时，宿主细胞的群体的细胞或子集产生可检测输出，并且任选地其中表达载体在宿主细胞的群体的细胞或子集中产生比携带参照途径的参照载体(例如编码不产生足以调节目的蛋白质的活性的浓度和/或效力的分子的途径的载体)的输出更高的可检测输出。
28.在一些实施方案中，宿主细胞包含基因编码系统，其中目的蛋白质的活性控制蛋白质复合物的组装，并因此产生与形成的复合物的量成比例的可检测输出，该蛋白质复合物的活性是该复合物的两种或更多种组分中的任一种不具有的。
29.在一些实施方案中，目的蛋白质是添加翻译后修饰的酶，该翻译后修饰导致初始解离的两种蛋白质共价连接或形成非共价复合物。
30.在一些实施方案中，复合物由解离常数(kd)小于或等于sh2结构域与其磷酸化底物之间形成的复合物的kd的两种蛋白质形成。
31.在一些实施方案中，代谢途径产生苯丙素类或非核糖体肽。
32.在一些实施方案中，包含不同代谢途径的表达载体包含通过使起始代谢途径中的一个或多个基因突变而产生的途径文库。
33.在一些实施方案中，代谢途径中一种或多种包含具有未知生物合成能力的基因的集合。
34.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生与其他代谢途径的产物不同的产物。
35.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生比其他代谢途径产生的产物量更大量的产物。
36.在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种表现出比其他代谢途径更低的细胞毒性。
37.在一些实施方案中，目的蛋白质是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶或相关的水解酶。
38.根据另一方面，提供了试剂盒，其包括如本文所述的表达载体的群体。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包括包含本文所述的目的蛋白质的宿主细胞的群体。
39.本发明的每个限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此预期涉及任何一个要素或要素组合的本发明的每个限制均可以包括在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的结构和部件布置的详细信息。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。
附图说明
40.图1a-1e.将ptp1b的抑制与抗生素抗性联系起来的细菌-双杂交系统的开发。图1a，检测磷酸化依赖性蛋白质-蛋白质相互作用的细菌双杂交(b2h)系统。主要组分包括(i)与rna聚合酶的ω亚基融合的底物结构域(黄色)，(ii)与434噬菌体ci阻遏物融合的sh2结构域(浅蓝色)，(iii)针对434ci的操纵子(深绿色)，(iv)针对rna聚合酶的结合位点(紫色)，(v)src激酶和(vi)ptp1b。src催化的底物结构域磷酸化启动了激活目的基因(goi，黑色)的转录的底物-sh2相互作用。ptp1b催化的底物结构域去磷酸化阻止了这种相互作用；抑制ptp1b使其重新启动。图1b，b2h系统的某形式，其(i)缺少ptp1b并且(ii)含有作为底物结构域的p130cas和作为goi的luxab。诱导型质粒用于增加大肠杆菌(e.coli)中特定组分的表达；来自一种此类质粒的对src的二次诱导使发光增强。图1c，b2h系统的某形式，其(i)缺少ptp1b和src并且(ii)包括对磷酸肽具有增强的亲和力的sh2结构域(sh2*)、可变底物结构域和作为goi的luxab。诱导型质粒用于增加大肠杆菌中src的表达。显示了底物p130cas(seq id no:24)、midt(seq id no:25)、egfr(seq id no:27)和shca(seq id no:26)的序列。图1d，来自c的b2h系统，其具有作为底物的p130cas或midt。使用第二质粒在大肠杆菌中过表达(i)src和ptp1b或(ii)src和ptp1b(c215s)的无活性变体。右侧：两个单质粒b2h系统。图1e，优化的系统包括sh2*、midt底物、优化的启动子和核糖体结合位点(来自图1d的bb034)以及作为goi的specr。ptp1b的失活使带有这种质粒携带系统的大肠杆菌菌株能够在高浓度大观霉素(》250μg/ml)下存活。图1b-图1d中的误差线表示标准误差，n＝3次重复。
41.图2a-2c.抑制ptp1b的萜类的生物合成使细胞存活。图2a，针对萜类生物合成的质粒携带途径：(i)pmbis，其带有酿酒酵母(s.cerevisiae)的甲羟戊酸依赖性类异戊二烯途径，将甲羟戊酸转化为焦磷酸异戊酯(ipp)和焦磷酸法呢酯(fpp)。(ii)pts，其编码萜烯合酶(ts)，且在必要时编码香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)，将ipp和fpp转化为倍半萜烯或二萜烯。图2b，四种萜烯合酶：紫穗槐二烯合酶(ads)、γ-葎草烯合酶(ghs)、松香二烯(abietadiene)合酶(abs)和紫杉二烯合酶(txs)。图2c，携带(i)细菌双杂交(b2h)系统(ii)ts特异性萜类途径(仅在abs或txs存在时pts包括ggpps)的大肠杆菌菌株的大观霉素抗性。ads使得能够在存在高浓度大观霉素的情况下存活。注：abs
d404a/d621a
无催化活性。b2h*含有无活性的ptp1b
c215s
。
42.图3a-3g.微生物辅助定向进化(made)的策略。图3a，代谢途径内基因子集的易错pcr和/或位点饱和诱变产生代谢途径文库。图3b，微生物，每一种均带有(i)b2h系统和(ii)途径文库的成员，在液体培养基中生长。注：所示系统是大肠杆菌宿主，其带有(i)b2h系统和(ii)突变的萜类途径(即pmbis+pts，具有突变；见图2a)。图3c，液体培养后，将转化体接种在含有不同浓度的抗生素的固体培养基上；命中包括在野生型途径不允许生长的抗生素浓度下生长的菌落。图3d，对命中的途径进行测序；它们的突变被重新引入野生型途径；并且这些重构的途径变体在含有不同浓度抗生素的固体培养基上通过基于液滴的铺板(10μl)重新筛选。此步骤消除假阳性(例如，由于位于靶基因之外的突变而存活的菌落)。图3e，确认的命中在液体培养基中生长；它们的产物根据需要用己烷覆盖层提取，并在旋转蒸发仪中浓缩。图3f，gc/ms使得能够鉴定和定量突变产物；nmr可以有助于鉴定。图3g，通过体外动力学测量或靶向调节的细胞研究和/或靶-代谢物结合的itc分析来表征目的代谢物(购
买或从培养提取物纯化)。
43.图4a-4d.检测翻译后修饰(ptm)酶的代谢物介导调节的基因编码系统。图4a，检测酶e1和/或e2的代谢物介导激活的基因编码系统。e1向蛋白质p1添加ptm，使其与p2结合；新形成的p1-p2复合物激活目的基因(goi，黑色)的转录。e2从p1中去除ptm，从而防止复合物形成。当goi赋予适应性优势时，e2抑制剂或e1激活剂提高细胞存活率。当goi具有毒性时，e1抑制剂或e2激活剂提高细胞存活率。图4b，可选的检测系统。e1向蛋白质p1添加ptm，使其与p2结合；新形成的p1-p2复合物组装脱落蛋白(例如，荧光蛋白、荧光素酶或赋予抗生素抗性的酶)。e2从p1中去除ptm，从而防止复合物的形成。当重构的脱落蛋白具有适应性优势时，e2抑制剂或e1激活剂提高细胞存活率。相反，当重构的蛋白具有毒性时，e1抑制剂或e2激活剂提高细胞存活率。图4c，检测控制蛋白质连接的ptm酶(例如，sumo转移酶、泛素连接酶或相关的肽酶)的代谢物介导激活的基因编码系统。e1将p1附接至p2的赖氨酸残基(k)，并且新形成的p1-p2复合物激活goi的转录。e2使该复合物分解。图4d，可选的系统。e1将p1附接至p2，并且新形成的p1-p2复合物允许组装脱落蛋白。e2介导的蛋白水解使该复合物分解。
44.图5a-5c.可选的代谢途径。图5a，由young-soo hong及其同事
45
开发的苯丙素途径。缩写：tal，来自西班牙糖丝菌(s.espanaensis)的脱氨酶；sam5，来自西班牙糖丝菌的4-香豆酸3-羟化酶；com，来自拟南芥(a.thaliana)的o-甲基转移酶；scccl，来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)的肉桂酸盐/4-香豆酸盐：coa连接酶；chs，来自拟南芥的查尔酮基合酶；sts，来自花生(arachis hypogaea)的芪合酶。图5b，由来自图5a的质粒编码的途径。图5c，可遗传编码的耶尔森菌素(yersiniabactin，ybt)合酶，如khosla及其同事所描述的
46
。ybt是聚酮化合物-非核糖体肽。ybt产生所需的底物以蓝色显示。缩写：arcp，芳基载体蛋白；a，腺苷酸化；pcp，肽基载体蛋白；cy，环化；ks，酮基合酶；acp，酰基载体蛋白；at，酰基转移酶；kr，nadph依赖性酮还原酶；mt，甲基转移酶；sam，s-腺苷甲硫氨酸；te，硫酯酶。有关生物合成的详细信息，见正文。
45.图6a-6b.用于发现隐蔽代谢途径的方法。图6a，多步骤途径的诱变和/或重组使生物合成基因失活，因此使得代谢中间体蓄积。图6b，多步骤途径的诱变和/或重组使阻遏基因失活，因此使得途径基因的表达。
46.图7a-7i.萜类抑制剂的微生物进化。图7a-图7b，(图7a)ads和(图7b)ghs的同源模型显示了位点饱和诱变(ssm)靶向的残基位置。来自5-表-马兜铃烯合酶(pdb条目5eat)的比对结构的底物类似物以蓝色显示。图7c-图7d，由(c)ads(lb平板)和(图7d)ghs(tb平板)的突变体赋予的大观霉素抗性的测量。alp对应于ghs的五重突变体(a336c/t445c/s484c/i562l/m565l)，其产生作为主要产物的α-长叶蒎烯。阴影表示菌落密度：扩散(≥10个菌落，浅灰色)、圆形扩散(灰色)和圆形菌苔(黑色)。图7e，能够在比野生型酶更高的抗生素浓度下生长的ads突变体的产物谱。图7f，ads
g43s/k51n
和ads在液体培养物中产生相似的紫穗槐二烯滴度。图7g，在无活性b2h系统(b2hx)存在下，ads
g43s/k51n
产生比野生型酶更高的菌落密度；这些密度表明ads
g43s/k51n
的毒性低于ads。图7h，野生型ghs和产生增强的抗生素抗性的几种ghs突变体的产物谱；这些突变体谱之间的差异表明细胞内萜类的组成存在差异，这可能导致抗生素抗性增强。图7i，ghs
a319q
产生比ghs更高的萜类滴度。图7f和图7i中的误差线表示标准偏差，其中n＝3次生物学重复。
47.图8a-8d.进化突变体分析。图8a，ads突变体赋予的抗生素抗性分析。图像显示大肠杆菌在从液体培养液滴(10μl)接种的lb平板上生长。通过使用定点诱变将选择实验中鉴定的突变(即命中)引入起始ads质粒来制备每个突变体。阴影表示菌落密度：扩散(≥10个菌落，浅灰色)、圆形扩散(灰色)和圆形菌苔(黑色)。图8b，图8a中描述的实验的重复。图8c，ghs突变体赋予的抗生素抗性分析。图像显示大肠杆菌在从液体培养液滴(10μl)接种的tb平板上生长。图8d，图8c中描述的实验的重复。在图8a-图8d中，蓝色突出显示指示在两次生物学重复中能够在比野生型酶更高的大观霉素浓度下生长(即，这些突变体出现在图3c和3d中)的突变体。
48.图9a-9c.不同萜烯合酶的产物分析。图9a，在不存在(上图)和存在(下图)b2h系统的情况下，由每个ts特异性菌株产生的主要萜类(即紫穗槐二烯、γ-葎草烯、紫杉二烯或松香二烯)的滴度。相似的滴度表明b2h系统不干扰萜类生物合成。图9b，在不存在(上图)和存在(下图)b2h系统(m/z＝204)的情况下，由每个菌株产生的萜类的gc/ms色谱图。类似谱图表明b2h系统不改变产物分布。图9c，分析(i)ts活性或(ii)b2h功能对各种菌株的死亡和存活的贡献。ghs的失活未提高ghs菌株的存活，这表明这种酶不产生抑制生长的萜类。相反，ads或b2h系统的失活削弱ads菌株的抗生素抗性，这表明最大抗性需要萜类产生和b2h激活。标记示出以下对照：ghs
d/a
，无活性ghs；ads
d/a
，无活性ads；b2h*，组成型活性b2h；b2h
x
，无活性b2h。注：左图和右图显示了接种有来自两次生物学重复的液体培养液滴(10μl)的lb平板。图9a中的误差线表示n≥3次生物学重复的标准误差。
49.图10a-10e.各种萜类产物的分析。图10a，色谱图显示了来自图2c(存在b2h系统)的每个ts特异性菌株的预期主导产物(*)。图10b，ads和txs产生的主要产物的滴度。图10c，在存在浓度增加的紫穗槐二烯和紫杉二烯的情况下，ptp1b催化的pnpp水解的初始速率。线条显示拟合至michaelis-menten模型，其提供了非竞争性抑制(紫穗槐二烯)和混合抑制(紫杉二烯)的证据。图10d，hek293t/17细胞的描述。胰岛素刺激膜结合胰岛素受体(ir)的磷酸化；ptp1b使ir去磷酸化，并且抑制ptp1b可恢复磷酸化。图10e，在暴露于3％二甲基亚砜(dmso，n＝2)、930μm紫穗槐二烯(ad，在3％dmso中，n＝3)和405μmα-红没药烯(abis，3％dmso，n＝1)10分钟的饥饿的野生型hek293t/17细胞中ir磷酸化的基于elisa的测量。结果表明，紫穗槐二烯和α-红没药烯均可以穿过细胞膜，抑制细胞内ptp1b，从而增加ir磷酸化。图10b中的误差线表示标准误差，其中n＝3次生物学重复。图10c中的误差线表示n≥3次测量的标准误差。图10e中的误差线表示标准误差，其中显示n值(我们注意到：对于这些测量，我们减去了仅由裂解缓冲液产生的参考信号，n＝3)。
50.图11a-11d.可选的萜烯合酶分析。图11a-图11b，携带(i)活性或无活性细菌双杂交系统(b2h和b2hx，分别如图1、2和7-9中)和(ii)具有每种以下萜烯合酶的来自图2的萜类途径的大肠杆菌菌株的大观霉素抗性：来自大冷杉(abies grandis)的γ-葎草烯合酶(ghs)、来自生姜(zingiber officinale)的β-红没药烯合酶(zobba)、来自檀香(santalum album)的β-红没药烯合酶(sabba)和来自大冷杉(abs)的α-红没药烯合酶(abb)。sabba和最突出的abb使得能够在高浓度的大观霉素下存活。图11c，β-红没药烯和α-红没药烯的化学结构。图11d，在存在浓度增加的从培养提取物中纯化的β-红没药烯(测量为紫穗槐二烯当量)的情况下，分析ptp1b对磷酸对硝基苯酯(pnpp)的活性。线条显示拟合至michaelis-menten模型。
51.图12a-12g.ptp1b选择性抑制剂的分析。图12a，在存在浓度增加的紫穗槐二烯的情况下，由ptp1b
321
、tcptp
292
和ptp1b
282
的pnpp水解的初始速率。线条显示拟合至抑制模型。第一个和第二个图的比较(或更具体地，从绘图数据得出的ic
50
)表明，紫穗槐二烯是与人类基因组中最密切相关的ptp(通过序列同一性)——tcptp
292
——相比约5倍强效的ptp1b
321
抑制剂；这种选择性表明紫穗槐二烯结合在ptp1b的活性位点之外。反过来，第二个和第三个图的比较表明，紫穗槐二烯对ptp1b
282
的抑制强度比ptp1b
321
弱四倍；这种差异表明在ptp1b
321
中存在但在ptp1b
282
中缺失(并且其靠近ptp1b的已知变构结合位点)的α7螺旋参与了ptp1b
321-紫穗槐二烯相互作用。图12b，紫穗槐二烯的化学结构。图12c，与紫穗槐二烯结合的ptp1b的初步晶体结构。图12d，用于解析图12c中结构的数据显示了ptp1b的变构位点附近的电子密度(f280出现在该图像的左侧)；该密度与紫穗槐二烯的结构一致。图12e，α-红没药醇(α-红没药烯的结构类似物)的化学结构。图12f，与α-红没药醇结合的ptp1b的初步晶体结构。图12g，用于解析图12f中结构的数据显示了ptp1b的变构位点附近的电子密度(f280出现在该图像的左上方)；该密度与α-红没药醇的结构一致。
52.图13.细菌-双杂交(b2h)系统的优化。图13，我们通过调整各种遗传元件的强度来优化b2h系统的转录反应。在三个连续的阶段，我们改变了(1)src/cdc37的启动子，(2)src/cdc37的核糖体结合位点(rbs)和(3)ptp1b的rbs。在阶段1和阶段2，我们使用具有野生型(wt，epqyeeipyl(seq id no:1))或非磷酸化(mut，epqfeeipyl(seq id no:2))底物结构域的ptp1b缺陷系统。此处，“无”表示不存在另外的启动子；标记的“pro1”控制其左侧所有五个基因的转录。在阶段3，我们使用具有ptp1b的野生型(wt)或无催化活性(c215s，mut)变体的完整b2h系统。表2中详细说明了每个阶段的剩余b2h组分。误差线表示标准误差，其中n≥3次生物学重复。
53.图14.不同选择条件的分析。图14，具有针对ptp1b的不同rbs的b2h系统所赋予的抗生素抗性的比较(有关每个系统的其余组分见表2)。图像显示了大肠杆菌在从液体培养液滴(10μl)接种的琼脂平板(lb)上的生长，每种条件均进行两次生物学重复。rbs bb034对琼脂平板上的大观霉素具有更高敏感性；相反，液体培养物中大观霉素的浓度对细菌生长没有强影响。根据该分析，我们将bb034纳入我们的“优化”的b2h系统，并停止在液体培养中添加大观霉素。
54.图15a-15b.图15a，纯紫穗槐二烯(购自ambeed)的gc色谱图。图15b，图15a所示峰的质谱。
55.图16a-16b.γ-葎草烯产生的gc/ms分析。图16a，gc色谱图显示了由经工程化以产生γ-葎草烯的大肠杆菌菌株(即pmbis+pghs)的γ-葎草烯产生。图16b，图16a所示峰的质谱。
56.图17a-17b.补充图4|松香二烯产生的gc/ms分析。图17a，gc色谱图显示了由经工程化以产生松香二烯的大肠杆菌菌株(即pmbis+pabs)的松香二烯产生。图17b，图17a所示峰的质谱。
57.图18a-18b.紫杉二烯产生的gc/ms分析。图18a，gc色谱图显示了纯紫杉二烯(phil baran友情馈赠)的产生。图18b，图18a所示峰的质谱。
58.图19a-19b.β-红没药烯产生的gc/ms分析。图19a，gc色谱图显示了由经工程化以产生β-红没药烯的大肠杆菌菌株(即pmbis+pghs
l450g
)的β-红没药烯产生。图19b，图19a所示
峰的质谱。
59.图20.pnpp测定的标准曲线。该标准曲线是通过将不同浓度的对硝基苯酚(p-np)溶解于100μl水中并用酶标仪测量其吸光度而生成的。使用该曲线将在我们的pnpp动力学分析中收集的吸光度测量值转换为浓度。
60.图21a-21e.将ptp1b的抑制与抗生素抗性联系起来的细菌-双杂交系统的开发。该图通过包括基因的方向来详细说明图1。图21a，细菌双杂交(b2h)系统，其中磷酸化依赖性蛋白质-蛋白质相互作用调节目标基因(goi，黑色)的转录。主要组分包括(i)与rna聚合酶的ω亚基融合的底物结构域(黄色)、(ii)与434噬菌体ci阻遏物融合的sh2结构域(浅蓝色)、(iii)src激酶和ptp1b、(iv)针对434ci的操纵子(深绿色)、(v)针对rna聚合酶的结合位点(紫色)和(vi)目的基因(goi，黑色)。图21b，由具有p130cas底物、作为goi的luxab并且没有ptp1b的b2h系统产生的发光。
61.我们使用诱导型质粒来增加特定组分的表达。图21c，由具有对磷酸肽表现出增强的亲和力的sh2结构域(sh2*，四个底物结构域之一)、作为goi的luxab并且没有src或ptp1b的b2h系统产生的发光。
62.我们使用诱导型质粒来控制src的表达。显示了底物p130cas(seq id no:24)、midt(seq id no:25)、egfr(seq id no:27)和shca(seq id no:26)的序列。图21d，来自c的b2h系统，具有p130cas或midt底物。我们使用第二质粒来控制src和ptp1b的活性或无活性(c215)变体的表达。右图：两个优化的单质粒系统。图21e，最终的b2h系统。ptp1b的失活使携带该系统的大肠杆菌菌株能够在高浓度的大观霉素(》250μg/ml)下存活。图21b-d中的误差线表示n＝3次生物学重复的标准误差。
63.图22a-22g.抑制ptp1b的萜类的生物合成使细胞存活。该图详细说明了图2和10。图22a，萜类生物合成的质粒携带途径：(i)pmbis
cmr
，其带有酿酒酵母的甲羟戊酸依赖性类异戊二烯途径，将甲羟戊酸转化为焦磷酸异戊酯(ipp)和焦磷酸法呢酯(fpp)。(ii)pts，其编码萜烯合酶(ts)，必要时编码香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)，将ipp和fpp转化为倍半萜烯或二萜烯。图22b，本研究中检测的五种萜烯合酶：紫穗槐二烯合酶(ads)、γ-葎草烯合酶(ghs)、α-红没药烯合酶(aba)、松香二烯合酶(abs)和紫杉二烯合酶(txs)。图22c，带有(i)细菌双杂交(b2h)系统和(ii)ts特异性萜类途径的大肠杆菌菌株的大观霉素抗性。注：abs*是阳性对照，具有组成型活性b2h(即，它包括ptp1b
c215s
)。图22d，色谱图显示了在存在b2h系统的情况下来自c的每个ts特异性菌株的预期主要产物(即，同名；*)。将值归一化为给定样品中的最大峰值。图22e，在浓度增加的(ad)紫穗槐二烯或(ab)α-红没药烯的情况下，pnpp的ptp1b催化水解的初始速率。线条显示抑制的最佳拟合动力学模型(表12)。图22f，ic
50
的估计值。图22g，ads和aba产生的主要产物的滴度。误差线表示(图22e)标准误差和(图22f)n≥3次独立测量的95％置信区间，以及(图22g)n＝3次生物学重复的标准偏差。
64.图23a-23h.萜类介导抑制的生物物理分析。通过包括另外的动力学测量在图12的基础上建立该图。图23a.与tcs401(竞争性抑制剂)(黄色蛋白质、橙色突出显示和绿色球体；pdb条目5k9w)和bbr(变构抑制剂)(灰色蛋白质、蓝色高光和浅蓝色球体；pdb条目1t4j)结合的ptp1b的比对x射线晶体结构。图23b，与bbr(白色蛋白质和浅蓝色配体)和紫穗槐二烯(青色蛋白质和深蓝色配体，pdb条目6w30)结合的ptp1b的比对结构。图23c，双氢青蒿酸(dha)是具有可能破坏与疏水裂隙的结合的羧基的紫穗槐二烯的结构类似物。图23d，dha的
效力比紫穗槐二烯低八倍。线条显示抑制的最佳拟合动力学模型(表12)。误差线表示n＝3次独立测量的标准误差，ic
50
的置信区间为95％。图23e，显示在各种ad浓度下v
o-1
相对于[tcs401]的dixon图(黑色、蓝色、紫色标记)。平行线表示tcs401和ad不能同时结合。图23f，显示在各种ad浓度下v
o-1
相对于[原钒酸盐]的dixon图(黑色、蓝色、紫色标记)。相交线表明原钒酸盐和ad可以同时结合。图23g，紫穗槐二烯和α-红没药烯均比tc-ptp更有效地抑制ptp1b；从两种酶中去除α7螺旋(或等同物)降低ad的选择性，但不降低ab的选择性。误差线显示根据每个条件下n≥3次独立测量估计的传播的95％置信区间。图23h，紫穗槐二烯(930μm)和α-红没药烯(405μm)在hek293t/17细胞中刺激ir磷酸化；在相同浓度下，双氢青蒿酸(dha)和α-红没药醇(abol)表现出与其降低的效力一致的信号降低(#：p《0.05，与阴性对照相比，*：p《0.05)。所有抑制剂均溶于3％dmso(v/v；阴性对照)。图23d-f中的误差线表示n＝3-12次生物学重复的标准误差。图23g中的误差线表示n≥3次独立测量的传播的95％置信区间。图23h中的误差线表示从仅缓冲液对照传播的标准误差(n＝3次生物学重复)。
[0065]
图24a-24e.未表征的萜烯合酶基因的分析。图24a，萜烯合酶的生物信息学分析。我们组装了最大的萜烯合酶家族(pf03936)的4,464个成员的进化分枝图，并用功能数据对其进行注释。我们从八个进化枝(弯曲框)中的每一个中选择三个基因：六个进化枝没有表征的基因(即具有已知功能的基因)和两个进化枝没有表征的基因。图24b，由选择的基因连同pmbis
cmr
和pb2h
opt
赋予的大观霉素抗性。超过400ug/ml大观霉素下的强劲增长的命中显示为蓝色。“n.m.”表示条件未测量。图24c，a0a0c9vsl7产生(+)-1(10),4-杜松二烯((+)-1(10),4-cadinadiene)作为主要产物(m/z＝204)。图24d，(+)-1(10),4-杜松二烯的结构。图24e，(+)-1(10),4-杜松二烯(85％纯度，10％dmso)对ptp1b的抑制。线条显示抑制的最佳拟合动力学模型(表12)。
[0066]
图25a-c.|扩展到其他与疾病相关的ptp。图25a，带有经修饰以检测不同疾病相关ptp失活的b2h系统的菌株的大观霉素抗性。失活突变
86-88
赋予高浓度抗生素存活。图25b，在存在紫穗槐二烯和α-红没药烯(即pmbis
cmr
+ads或aba)代谢途径的情况下由ptp1b和tc-ptp特异性b2h系统赋予的抗性比较。ptp1b特异性系统表现出显著的存活优势，这一发现与两种萜类对该酶的选择性一致。图25c，带有b2h系统和相关代谢途径的菌株中ad和ab的滴度在菌株之间无法区分。
[0067]
图26a-d.不同萜烯合酶产物的分析。通过包括另外的测量值在图9的基础上建立该图。图26a，在不存在(红色)和存在(蓝色)b2h系统的情况下，由每个ts特异性菌株产生的总萜烯滴度。这些结果表明b2h系统不破坏萜类的生物合成。图26b，在不存在(上图)和存在(下图)b2h系统的情况下，由二萜烯合酶产生的萜类的gc/ms色谱图(m/z＝272)。图26c，在不存在(上图)和存在(下图)b2h系统的情况下，由倍半萜烯合酶产生的萜类的gc/ms色谱图(m/z＝204)。图26b和图26c中的类似曲线表明b2h系统不改变产品分布。图26d，分析(i)ts活性或(ii)b2h功能对ghs、ads和aba菌株的死亡和存活的贡献。ghs失活不提高存活率，这表明这种酶不产生抑制生长的萜类。相反，ads、aba或b2h系统的失活削弱ads和aba菌株的抗生素抗性；因此，最大抗性需要萜类产生和b2h激活。标记示出以下对照：d/a，无活性萜烯合酶(在催化性天冬氨酸处含有d/a突变，防止萜烯环化中的初始金属结合步骤)；*，组成型活性b2h(含有ptp1b
c215s
，防止去磷酸化)；x，无活性b2h(含有具有y/f突变的底物结构域，禁止磷酸化并因此与sh2结构域结合)。图像显示接种有来自两次生物学重复的液体培养物的
液滴(10μl)的lb平板。表2详细说明了用于这些分析的b2h系统。图26a中的误差线表示n≥3次生物学重复的标准偏差。
[0068]
图27.带注释的萜烯合酶进化分枝图。pf03936家族的这个进化分枝图被热图包围，该热图显示了uniprot数据库中已知ec编号的4.2.3.#形式(其包括萜烯环化反应)的存在/不存在。我们从八个进化枝中的每一个中选择三个基因：六个进化枝没有表征的基因(红色)，两个具有表征的基因(蓝色)。表1总结了基因。
[0069]
图28.选择基因的分析。我们通过筛选24个未表征基因中的每一个连同fpp途径(即pmbis)来搜索ptp1b的倍半萜烯抑制剂。这些图片显示了每个基因赋予的抗生素抗性。我们选择了抗生素抗性超过400μg/ml的菌株作为命中(蓝色)。重要的是，对于这些基因，b2hx对照的存活率降低表明增强的抗性需要激活b2h系统。在上图中，n.m.表示未测量的条件。
[0070]
图29.选择的命中的产物谱。选择的命中的产物谱(提取离子色谱图，m/z＝204)。简言之，我们使命中(即pb2h
opt
、pmbis
cmr
和pts)在液体培养物中生长72小时。除a0a0g2zsl3外，所有命中均在10ml的2％tb中生长；a0a0g2zsl3在2％tb的4ml培养物中生长。值得注意的是，a0a0c9vsl7和a0a2h3dku3均产生了一个主导产物：分别为(+)-1(10),4-杜松二烯和β-金合欢烯。我们专注于a0a0c9vsl7，因为(+)-1(10),4-杜松二烯是我们最初筛选中鉴定的抑制剂紫穗槐二烯的结构类似物。
[0071]
图30.与ad结合的ptp1b的晶体学分析。在(左图)存在或(右图)不存在ad的情况下收集的ptp1b晶体结构。分辨率：分辨率：(ptp1b-ad)和(ptp1b)。我们通过建模(上图)ptp1b-ad复合物或(下图)载脂蛋白形式ptp1b来改进这些结构。对于用ad浸泡的ptp1b(左图)，1.0σ2fo-fc电子密度支持ad的建模位置，但表明存在多种构象；即使从模型中排除ad，也出现这种密度。对于载脂蛋白ptp1b(右图)，1.0σ2fo-fc电子不支持结合的ad分子；具有无法解释的密度的小区域可能反映了水分子或部分α7螺旋占据
15
。
[0072]
图31.与abol结合的ptp1b的晶体学分析。在(左图)存在或(右图)不存在abol的情况下收集的ptp1b晶体结构。分辨率：分辨率：(ptp1b-abol)和(ptp1b)。我们通过建模(上图)ptp1b-abol复合物或(中/下图)载脂蛋白形式ptp1b来改进这些结构。对于用abol浸泡的ptp1b(左图)，0.90σ2fo-fc电子密度与abol的模拟位置一致，但当从模型中排除abol时，其变得较不明显。载脂蛋白形式ptp1b(右图)在两种模型中显示出相似的密度；数据集之间0.90σ2fo-fc电子密度形状的微小差异表明该密度可能具有不同的起源(例如，配体相对于部分α7螺旋占据)。明确确定α-红没药醇的结合位点需要另外的数据。
[0073]
图32a-32c.多重结合构象的证据。图32a，来自结合至紫穗槐二烯(ad)的ptp1b的分子动力学(md)模拟的快照。箭头表示配体簇。图32b，与ad结合的ptp1b的晶体结构突出了经历高频接触的残基。此处，接触的残基-配体距离并且高频超过md模拟中所有快照的10％。图32c，完整系统(pl)、蛋白质(p)、蛋白质核心(p
核心
；残基1-287)、蛋白质的无序区域(p
尾
；残基288-321)和md模拟上的配体(l)的平均均方根偏差(rmsd)的估计值表明ad和蛋白质的无序区域均是可移动的(后者比前者更易移动)，而蛋白质核心保持固定。(i)重新居中的配体(int)，即旋转和振动波动的度量；以及(ii)配体的质心(com)，即其位置偏差的度量，的平均rmsd很大，表明配体可以采用多种结合构象和/或位置。
[0074]
图33a-33m.动力学分析总结。图33a，ptp1b(灰色，pdb条目5k9w)和tc-ptp(蓝色，pdb条目1l8k)的比对晶体结构。ptp1b的突出显示：竞争性抑制剂(橙色)、α7螺旋(红色)和用于动力学研究的截断点(281和283，tc-ptp的281等同物)。图33b，ptp1b(seq id no:140)和tc-ptp(seq id no:141)的α6/7区的序列比对。我们的动力学分析中使用截断点。如图33c所示，bbr(灰色，pdb条目1t4j)和紫穗槐二烯(蓝色)的结合位点的比对结构。图33d-图33m，在存在浓度增加的(图33d-图33g)紫穗槐二烯、(图33h-图33k)α-红没药烯、(图33l)双氢青蒿酸和(图33m)α-红没药醇抑制的情况下，各种ptp水解pnpp的初始速率。在所有图中，线条显示抑制的最佳拟合模型(表12)。图33d-图33m中的误差线表示至少3次测量的标准误差。ic
50
的误差代表由拟合抑制模型确定的95％的置信区间(表12)。
[0075]
图34a-34d.选择性的扩展分析。图34a，shp1的ad抑制的初始速率数据。下图显示了与在两种不同底物浓度(开放相对于封闭圆圈)下的子集点的抑制％相同的数据。图34b，shp2的ad抑制的初始速率数据。下图显示了与在两种不同底物浓度(开放相对于封闭圆圈)下的子集点的抑制％相同的数据。图34c，shp1的ab抑制的初始速率数据。下图显示了与在两种不同底物浓度(开放相对于封闭圆圈)下的子集点的抑制％相同的数据。图34d，shp2的ab抑制的初始速率数据。下图显示了与在两种不同底物浓度(开放相对于封闭圆圈)下的子集点的抑制％相同的数据。在图34a、图34c和图34d中，由于我们无法在ad的溶解度极限下测量抑制》25％(下图)，结合针对4-甲基伞形酮磷酸酯(4-mup)的高km，因此排除了准确的抑制模型拟合ki和ic
50
测定。然而，观察到的弱抑制表明ad/ab对这些酶的抑制作用不如对ptp1b强。在所有小图中，误差线表示n＝3次生物学重复的标准误差，并且线条显示非竞争性抑制模型拟合。
[0076]
图35a-35c.ptp1b介导的ir去磷酸化分析。图35a，hek293t/17细胞中胰岛素信号传导的描述。细胞外胰岛素与跨膜胰岛素受体(ir)结合，触发其细胞内结构域的磷酸化。ptp1b定位于哺乳动物细胞的内质网(er)，其使该结构域去磷酸化以调节下游信号传导通路。在饥饿的细胞中，外源提供的抑制剂可以穿透细胞膜并抑制ptp1b介导的ir去磷酸化。图35b，酶联免疫吸附测定(elisa)的抑制剂浓度筛选。与不同浓度的紫穗槐二烯、α-红没药烯及其结构类似物孵育的hek293t/17细胞中ir磷酸化的酶联免疫吸附测定(elisa)。我们使用此筛选来确定紫穗槐二烯和α-红没药烯的生物活性浓度以进一步研究。图35c，在与紫穗槐二烯(ad)、α-红没药烯(ab)、双氢青蒿酸(dha)和α-红没药醇(abol)孵育的hek293t/17细胞中ir磷酸化的基于elisa的测量。曲线表示四参数逻辑方程拟合：y＝d+(a-d)/(1+(x/c)^b)，其中y是450nm处的吸光度，并且x是样品稀释度(例如，1表示没有稀释，0.5表示2倍稀释，依此类推)。这些信号表明，与阴性对照(3％dmso)及其抑制性较低的类似物相比，紫穗槐二烯和α-红没药烯可以增加ir磷酸化。误差线表示n≥3次生物学重复的标准误差。
[0077]
图36a-36c.b2h介导的抗生素抗性的完整数据集。图36a，图22c的生物学重复。图36c，图25b的生物学重复。橙色突出显示对应于图2c和5a-b中显示的数据。
[0078]
图37a-37b.α-红没药烯产生的gc/ms分析。图37a，gc/ms色谱图显示了由工程化以产生α-红没药烯的大肠杆菌菌株(即pmbis+paba)的α-红没药烯产生。图37b，图37a所示峰的质谱。
[0079]
图38a-38b.图20补充图|(+)-1(10),4-杜松二烯的gc/ms分析。图38a，gc/ms色谱图显示了由经工程化以产生(+)-1(10),4-杜松二烯的大肠杆菌菌株(即pmbis+
pa0a0c9vsl7)的(+)-1(10),4-杜松二烯产生。图38b，图38a所示峰的质谱。
[0080]
图39a-39b.对硝基苯酚(p-np)的标准曲线。该图通过包括另外的测量来详细说明图20。图39a，我们将不同量的对硝基苯酚(p-np)溶解于100μl缓冲液(50mm hepes，ph＝7.3)中，并用spectramax m2酶标仪测量所得溶液的吸光度。该曲线的线性拟合使我们能够将在动力学测定(pnpp)期间测定的吸光度测量值转换为p-np浓度。图39b，我们将不同量的4-甲基伞形酮(4-mu)溶解于100μl缓冲液(50mm hepes，ph＝7.3)中，并用spectramax m2酶标仪测量所得溶液的荧光。该曲线的线性拟合使我们能够将在动力学测定(4-mup)期间测定的吸光度测量值转换为4-mu浓度。
具体实施方式
[0081]
大肠杆菌是产生萜类的有价值平台
27-29
。发明人假设，经编程以检测人用药物靶标失活的大肠杆菌菌株可能能够快速发现和生物合成抑制该靶标的萜类。为了对这种菌株进行编程，组装细菌双杂交(b2h)系统，其中来自智人(h.sapiens)的蛋白酪氨酸激酶(ptk)和蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)控制基因表达。ptk是30多种fda批准的药物的靶标
30
；ptp缺少临床批准的抑制剂，但导致大量疾病
31,32
。第一个概念验证系统专门设计用于检测蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)治疗2型糖尿病、肥胖症和乳腺癌的难以捉摸的治疗靶标的抑制剂(图1a)
31-35
。在该系统中，src激酶使底物结构域磷酸化，从而实现蛋白质-蛋白质相互作用，从而激活目的基因(goi)的转录。ptp1b使底物结构域去磷酸化，阻止了这种相互作用，而ptp1b的失活又使其重新启动。大肠杆菌是用于该检测系统的极佳宿主，因为它的蛋白质组与智人的蛋白质组充分正交，可以最大限度地减少src和ptp1b的调节活性导致的脱靶生长缺陷
36
。
[0082]
b2h开发分几个步骤进行。首先，组装发光“基础”系统，其中src调节底物结构域与底物同源性2(sh2)结构域的结合；该系统基于先前的设计，其中蛋白质-蛋白质缔合控制goi表达
37
。然而，初始系统并未产生磷酸化依赖的转录反应，因此它补充有诱导型质粒——各自携带不同的系统组成——以鉴定可能表现出次优活性的蛋白质。值得注意的是，src的二次诱导增加了发光，这表明底物磷酸化不足抑制基础系统中的goi表达(图1b)。因此，该系统通过交换不同的底物结构域，通过向sh2结构域添加突变以增强其对磷酸肽的亲和力
38
并通过去除src的基因进行修饰。使用这种配置，从第二个质粒诱导src增加了midt底物最显著的发光(图1c)；同时诱导src和ptp1b反过来又阻止了这种增加(图1d)。通过整合src和ptp1b的基因，通过调整启动子和核糖体结合位点以进一步放大其转录反应(图1d、13和14)，以及通过添加作为goi的大观霉素抗性基因(specr)，最终确定midt系统。最终的质粒携带检测系统需要ptp1b失活以实现在高抗生素浓度下生长(图1e)。
[0083]
b2h系统通过将ptp1b与可能在大肠杆菌中产生此类分子的代谢途径偶联来鉴定新的ptp1b抑制剂。先前的植物提取物筛选已鉴定抑制ptp1b39的结构复杂的萜类。因此，为缺少已确定的抑制作用的几种更简单的萜类支架构建了途径：紫穗槐二烯、γ-葎草烯、松香二烯和紫杉二烯。松香二烯是ptp1b弱抑制剂的代谢前体
40
；其他三种萜类代表分子的结构多样集合。每个途径由两个质粒携带模块组成(图2a)：(i)来自酿酒酵母的甲羟戊酸依赖性类异戊二烯途径
41
和(ii)当二萜类产生需要时补充有香叶基香叶基二磷酸合酶的萜烯合酶。这些模块使大肠杆菌中的萜类滴度为0.5-100μm(图9)。
[0084]
通过用携带目的途径和b2h系统的质粒转化大肠杆菌来筛选每个途径产生ptp1b
抑制剂的能力。gc-ms迹线证实，在存在b2h系统的情况下，所有途径均产生萜类(图2d)。出乎意料的是，紫穗槐二烯途径实现在高浓度抗生素下存活。重要的是，最大抗性需要功能性b2h系统(图9c)。该结果表明紫穗槐二烯途径产生ptp1b的抑制剂。
[0085]
微生物辅助定向进化(made)是指本文所述的用于使用微生物系统发现和进化治疗相关酶靶标的抑制剂或激活剂的代谢途径的方法，其中代谢途径和靶酶均存在于宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)中(图3)。该方法的一些方面提供了用于构建检测宿主细胞内靶酶的活性的基因编码系统例如，将靶酶活性的变化与宿主细胞的抗生素抗性变化联系起来的系统(图1)的方法。
[0086]
先前的工作证明(i)将蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性与抗生素抗性联系起来的检测系统的组装(图1)和(ii)该系统的使用，与made结合，以发现蛋白磷酸酶的抑制剂(图2)。这些结果在pct/us2019/40896中详细说明。
[0087]
本文描述了扩展made能力范围和满足先前描述的进化实验需求的策略、系统、方法和试剂。本文的made方法利用以下一项或多项：1)以不同于添加或去除磷酸基团的方式靶向翻译后修饰蛋白质的酶(ptm酶)；2)产生苯丙素或非核糖体肽的代谢途径；3)编码推定的天然产物的隐蔽的基因簇；和4)具有特异性抑制作用的天然产物。
[0088]
在一些实施方案中，提供了使用made来发现和进化产生ptm酶抑制剂或激活剂的代谢途径的方法(图3)，其中所述ptm酶调节控制可检测输出的蛋白质-蛋白质相互作用，其中ptm酶和可检测输出均由至少一种质粒或一种基因组编码，其中产生天然产物的代谢途径由至少一种质粒或一种基因组编码，并且其中所述质粒和基因组存在于同一宿主细胞内。在一些实施方案中，针对可检测输出筛选所述宿主细胞的池，每个宿主细胞含有不同的代谢途径，并且选择产生最高可检测输出的细胞作为命中。这些命中通过以下步骤进行分析：1)从起始途径重新组装它们的代谢途径；2)在宿主细胞中重新筛选重新组装的途径(确认步骤)；3)产生最高可检测输出的单元再次被选择作为命中；4)这些选择的细胞在液体培养基中生长；5)使用标准分析方法，例如气相色谱-质谱(gc/ms)，对所述液体培养中产生的产物进行鉴定和定量；6)将液体培养产生的产物用旋转蒸发仪浓缩；和7)在纯化的ptm酶上测试浓缩产物的调节作用(图3)。
[0089]
在一些实施方案中，靶ptm酶天然抑制宿主细胞例如酿酒酵母细胞的生长，其中异源表达的激酶减缓细胞生长。
[0090]
在一些实施方案中，ptm酶是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶和/或相关的水解酶。在一些实施方案中，细菌双杂交(b2h)系统将一种或多种ptm酶的活性与目的基因(goi；图4a)的转录联系起来。在一些实施方案中，ptm酶调节脱落蛋白(例如荧光蛋白、荧光素酶或赋予抗生素抗性的酶(图4b))的组装。在一些实施方案中，靶酶共价连接或蛋白水解两种蛋白质，其中这些蛋白质的组装激活目的基因的转录(图4c)或重新组装脱落蛋白(图4d)。
[0091]
在一些实施方案中，提供了用于发现和进化抑制或激活靶酶的苯丙素类或非核糖体肽的方法，其中产生苯丙素类或非核糖体肽的代谢途径由至少一种质粒或一种基因组编码(图5)，其中所述质粒和所述基因组存在于宿主细胞内，其中所述代谢途径的诱变和/或调节实现产生靶酶的抑制剂或激活剂，并且其中made能够鉴定由此突变和/或重新配置的途径。
[0092]
在一些实施方案中，提供了用于发现和进化产生靶酶的抑制剂或激活剂的隐蔽的代谢途径的方法，其中所述隐蔽的代谢途径包含具有未知或表征不佳的产物的基因的集合，或其中所述隐蔽的代谢途径包含基因的集合，其中一个基因阻碍重要产物的生物合成，其中所述途径的后续诱变和/或重新配置使其产生更多该产物，并且其中made能够发现由此突变和/或重新配置的途径。例如，去除生物合成基因可能蓄积调节靶酶活性的代谢中间体(图6a)；可选地，去除转录阻遏物的基因可能激活整个代谢途径(图6b)。
[0093]
在一些实施方案中，提供了用于发现和进化具有更高滴度和/或更低毒性的代谢途径的方法，其中起始途径经突变和/或重新配置以产生途径文库，并且使用made筛选所述途径文库以鉴定(i)产生比起始途径更高量的抑制剂或激活剂和/或(ii)表现出比起始途径更低毒性的途径(图7)。例如，诱变和/或重新配置的途径可以含有突变酶例如萜烯合酶的基因，该突变酶表现出比野生型酶更高的活性；可选地，诱变和/或重新配置的途径可以含有突变萜烯合酶的基因，该突变萜烯合酶比野生型酶更易溶解或毒性更低。
[0094]
本公开的一些方面提供了抑制蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)，例如蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b；图9和10)的分子。实例包括紫穗槐二烯及其衍生物、紫杉二烯及其衍生物、β-红没药烯及其衍生物、α-红没药烯及其衍生物，以及α-长叶蒎烯及其衍生物。在一些实施方案中，这些分子作为用于治疗ptp促成的疾病，例如，2型糖尿病
42
、her2阳性乳腺癌
43
或rett综合征
44
的药物或药物先导物，以及作为通过向需要此类治疗的对象施用有效量的分子来治疗此类疾病的方法提供。
[0095]
还提供了组合物或系统，其包括包含目的蛋白质的宿主细胞的群体和包含不同代谢途径的表达载体的群体，其中当代谢途径产生调节目的蛋白质的产物时，宿主细胞的群体的细胞或子集产生可检测输出，并且任选地其中表达载体产生比携带参考途径的参考载体(例如，编码不产生浓度和/或效力足以在宿主细胞的群体的细胞或子集中调节目的蛋白质的活性的分子的途径的载体)的输出更高的可检测输出。
[0096]
在一些实施方案中，宿主细胞包含基因编码系统，其中目的蛋白质的活性控制蛋白质复合物的组装，并因此在体内产生与形成的复合物量成比例的可检测输出，该蛋白质复合物的活性是该复合物的两种或更多种组分中的任一种均不具有的。在一些实施方案中，目的蛋白质是添加翻译后修饰的酶，该翻译后修饰导致初始解离的两种蛋白质共价连接或形成非共价复合物。在一些实施方案中，复合物由解离常数(kd)小于或等于sh2结构域与其磷酸化底物之间形成的复合物的kd的两种蛋白质形成。
[0097]
在一些实施方案中，由表达载体编码的代谢途径产生苯丙素类或非核糖体肽。在一些实施方案中，包含不同代谢途径的表达载体包含通过使起始代谢途径中的一个或多个基因突变产生的途径文库。在一些实施方案中，代谢途径中的一种或多种包含具有未知生物合成能力的基因的集合。
[0098]
在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生与其他代谢途径的产物不同的产物。在一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径中的一种或多种产生比其他代谢途径产生的产物的量更大量的产物。一些实施方案中，产生比参考途径的输出更高的可检测输出的代谢途径的一种或多种表现出比其他代谢途径更低的细胞毒性。
[0099]
在一些实施方案中，目的蛋白质是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基
化酶、乙酰转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶或相关的水解酶。
[0100]
本文还提供了包括如本文所述的表达载体的群体的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒还包括宿主细胞的群体，其包含如本文所述的目的蛋白质。
[0101]
以上概述意在以非限制性方式说明本文所述技术的一些实施方案、优点、特征和用途。从具体实施方式、附图、实施例和权利要求来看，本文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将显而易见。
[0102]
定义
[0103]
如本文所用，术语“代谢途径”是指能够合成代谢物的基因的集合。
[0104]
如本文所用，术语“代谢物”是指在活体系统内组装的有机分子。
[0105]
如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于900道尔顿的分子。
[0106]
如本文所用，术语“苯丙素类”是指由氨基酸苯丙氨酸和/或酪氨酸合成的有机化合物。
[0107]
如本文所用，术语“非核糖体肽”是指在没有信使rna的情况下合成的肽。例如，由非核糖体肽合酶合成的肽。
[0108]
如本文所用，术语“调节剂”是指改变另一种分子、肽、蛋白质、多核苷酸或实体的活性的分子、肽、蛋白质、多核苷酸或实体。
[0109]
如本文所用，术语“抑制剂”是指降低酶活性的小分子。
[0110]
如本文所用，术语“激活剂”是指增加酶活性的小分子。
[0111]
如本文所用，术语“天然产物”是指由活生物体产生的化合物或物质。
[0112]
如本文所用，术语“检测系统”是指将靶酶的活性与可检测输出联系起来的系统。
[0113]
如本文所用，术语“细菌双杂交(b2h)系统”是指将蛋白质-蛋白质相互作用与可检测输出联系起来的基因编码系统。
[0114]
如本文所用，术语“可检测输出”是指可以用标准分析仪器检测的输出。实例包括荧光、发光、抗生素抗性或微生物生长。
[0115]
如本文所用，术语“脱落蛋白”是指作为两个单独的半部存在的蛋白质，其在重新组装时恢复蛋白质的功能。
[0116]
如本文所用，术语“底物结构域”是指包括由目的蛋白质起作用的肽片段或蛋白质组分的蛋白质。例如，底物结构域可以包括目标激酶或磷酸酶靶向的受体蛋白的肽片段。
[0117]
如本文所用，术语“载体”是指用作载体以将外源遗传物质人工运载到细胞中的脱氧核糖核酸(dna)分子。
[0118]
如本文所用，术语“宿主细胞”是指made所必需的可以在载体或基因组上宿主基因编码系统的细胞。例如，因为宿主细胞可以含有编码(i)将靶酶的活性与可检测输出联系起来的遗传编码检测系统和(ii)能够合成可能或不可能抑制所述靶酶的分子的代谢途径的质粒。
[0119]
实施例
[0120]
实施例1
[0121]
在先前的工作中，用以下两个基因编码模块产生大肠杆菌菌株：将ptp1b的抑制与抗生素抗性基因的表达联系起来的b2h系统；以及产生紫穗槐二烯的代谢途径，其与具有不同代谢途径的相似菌株相比，表现出更大的抗生素抗性(图2)。在最近的工作中，该结果被
进一步探索。首先，结果表明，最大抗性需要活性紫穗槐二烯合酶(ads)和功能性b2h系统(图9)。其次，通过测量其针对磷酸对硝基苯酯(pnpp；图10c)的ptp1b催化水解的影响，证实了ads的主导产物紫穗槐二烯的抑制作用。初始速率表现出非竞争性的饱和行为特征或非竞争性抑制；最重要的是，紫穗槐二烯的ic
50
为约3μm，低于液体培养中产生的72μm的浓度。作为比较，紫杉二烯的ic
50
为119μm，该浓度远低于其在液体培养中的滴度。因此，体外研究的结果表明，紫穗槐二烯通过抑制ptp1b赋予抗生素抗性。最后，使用酶联免疫吸附测定(elisa)来证明紫穗槐二烯抑制hek293t/17细胞内ptp1b的能力(图10d-10e)。
[0122]
微生物系统提供了探索代谢途径如何进化以产生功能分子的令人感兴趣的机会。为了寻找ads和ghs活性的进化上可及的变化，以提高它们产生ptp1b抑制剂的能力，制备两种酶的突变体。对于ads，使用易错pcr和保守性差的残基的位点饱和诱变；对于ghs，野生型酶的位点饱和诱变与筛选几个先前开发的具有不同产物谱的突变体配对
47
(图7a，7b)。相比于野生型酶，来自每个文库的至少一个突变体一致赋予在更高的抗生素浓度下的存活率(图7c，7d)。
[0123]
ads的g34s/k51n突变体比其他突变体更能提高抗生素抗性，特别有意思的是，因为它的突变残基位于活性位点之外，既不改变产物谱也不改变滴度(图7e，f)。推测这些突变可能减少由异源ads表达引起的轻微生长缺陷(例如，它们可能减少包涵体的形成)。为了检验这一假设，比较在存在无活性b2h系统的情况下野生型和突变型菌株赋予的存活率；突变菌株在高浓度抗生素下表现出更强生长(图7g)。这些结果表明，工程化菌株可以选择毒性较低的酶突变体，在存在其他应激的情况下，这些突变体可能提高抑制性代谢物的产生。
[0124]
有趣的是，赋予增强的抗生素抗性(相对于野生型酶)的ghs突变体改变了产物谱和/或滴度(图7h和7i)。两个实例包括主要产生α-长叶蒎烯的ghs
a336c/t445c/s484c/i562l/m565l
(或alp)和使萜类的滴度提高了约十倍ghs
a319q
。因此，ghs突变体表明工程化菌株可以选择产生不同产物和/或比起始野生型酶更高滴度的酶突变体。
[0125]
为了扩展研究，还检查了主要产生β-红没药烯和α-红没药烯的萜烯合酶赋予的存活率。这两种酶均增强抗生素抗性；引人注意的是，从培养上清液中纯化的α-红没药烯的动力学研究表明该分子特别有效(即，在10％dmso中的ic
50
约20μm；图11)。
[0126]
萜烯合酶的分析结果表明，紫穗槐二烯及其衍生物、紫杉二烯及其衍生物、α-长叶蒎烯及其衍生物、β-红没药烯及其衍生物和α-红没药烯及其衍生物可提供药学相关ptp抑制剂的重要来源。
[0127]
方法
[0128]
细菌菌株。使用大肠杆菌dh10b、化学感受态neb turbo或电感受态one shot top10(invitrogen)进行分子克隆和萜类产生的初步分析；大肠杆菌bl2-de31用于表达蛋白质供体外研究；而大肠杆菌s1030
48
用于发光研究和所有涉及萜类介导生长的实验(即进化研究)。
[0129]
对于所有菌株，通过进行以下步骤产生化学感受态细胞：(i)将每种菌株接种在具有所需抗生素的lb琼脂平板上。(ii)将每种菌株的一个菌落接种于玻璃培养管中的1ml lb培养基(25g/l lb和表2中列出的适当抗生素)，并使该培养物生长过夜(37℃，225rpm)。(iii)将1ml培养物接种于玻璃摇瓶中的100-300ml lb培养基(如上)，并使该培养物生长数小时(37℃，225rpm)。(iv)当培养物的od达到0.3-0.6时，将细胞离心(在4℃下，4,000
×
g持
续10分钟)，去除上清液，将细胞重悬于30ml冰冷的tfb1缓冲液(30mm乙酸钾、10mm cacl2、50mm mncl2、100mm rbcl、15％v/v甘油，水至200ml，ph＝5.8，无菌过滤)中，并在4℃下孵育悬浮液90min。(v)重复步骤iv，但重悬于4ml冰冷的tfb2缓冲液(10mm mops、75mm cacl2、10mm rbcl2、15％甘油，水至50ml，ph＝6.5，无菌过滤)中。(iv)将最终悬浮液分成100μl等分试样并在-80℃冷冻直至进一步使用。
[0130]
通过遵循与上述类似的方法产生电感受态细胞。然而，在步骤iv中，将细胞重悬于50ml冰冷的milliq水中并重复此步骤两次——首先用50ml 20％无菌甘油(冰冷)，然后用1ml 20％无菌甘油(冰冷)。如前冷冻沉淀物。
[0131]
材料。松香酸甲酯购自santa cruz biotechnology；反式石竹烯、法尼醇、三(2-羧乙基)膦(tcep)、牛血清白蛋白(bsa)、m9低盐、苯甲基磺酰氟(pmsf)和dmso(二甲基亚砜)购自millipore sigma；甘油、细菌蛋白提取试剂ii(b-perii)和溶菌酶购自vwr；克隆试剂购自new england biolabs；紫穗槐二烯购自ambeed,inc.；所有其他试剂(例如抗生素和培养基组分)均购自thermo fisher。紫杉二烯由the scripps research institute的phil baran友情馈赠。通过将1体积的2m dl-甲羟戊内酯(mevalanolactone)与1.05体积的2m koh混合并在37℃下孵育该混合物30分钟来制备甲羟戊酸。
[0132]
克隆和分子生物学。所有质粒均使用标准方法(即限制性消化和连接、golden gate和gibson组装、quikchange诱变和环状聚合酶延伸克隆)构建。表1描述了每个基因的来源；表2和表3描述了所有最终质粒的组成。
[0133]
通过将来自pab094a的ha4-rpoz基因整合到pab078d中并通过用卡那霉素抗性标记(gibson组装)替换pab078d的氨苄青霉素抗性标记来开始构建b2h系统。反过来，通过分别用激酶底物和底物识别(即sh2)结构域替换ha4和sh2结构域(gibson组装)，并通过以各种组合(gibson组装)整合src激酶、cdc37和ptp1b的基因来修饰所得的“组合”质粒。功能性b2h系统通过用可增强其对磷酸肽的亲和力的几个已知突变(k15l、t8v和c10a，如kaneko等人
40
中编号)修饰sh2结构域，通过将用于发光(luxab)的goi与用于大观霉素抗性(specr)的goi交换，并通过切换启动子和核糖体结合位点以增强转录反应(gibson组装和quickchange mutagenesis,agilent inc.)来完成。注：对于最后一步，pro1到prod也使用quikchange协议进行转换。必要时，通过将b2h系统中的单一组分克隆到pbad(golden gate组装)中来构建具有阿拉伯糖诱导组分的质粒。表4和5列出了用于构建每个质粒的引物和dna片段。
[0134]
通过从addgene购买编码第一模块(pmbis)和倍半萜烯合酶(ptrc99a中的ads或ghs)的质粒并构建剩余的质粒来组装萜类生物合成的途径。将abs、txs和ggpps的基因整合到ptrc99t(即没有bsai位点的ptrc99a)中，并通过添加具有能够使紫穗槐二烯环氧化的三个突变的p450
bm3
基因来修饰pads的形式(f87a、r47l和y51f；p450g3；gibson组装和quickchange诱变)
49
。表6列出了用于构建每个质粒的引物和dna片段。
[0135]
发光测定。初步b2h系统(其中含有luxab作为goi)通过发光测定进行表征。简言之，将必要的质粒转化到大肠杆菌s1030(表2)中，将转化的细胞铺板到lb琼脂平板上(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠和5g/l酵母提取物，含表2中描述的抗生素)，并且所有平板在37℃下孵育过夜。单个菌落用于接种1ml极好肉汤(2％的tb或12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/l kh2po4、12.53g/l k2hpo4，ph＝7.0，含表2中描述
的抗生素)，我们培养这些培养物过夜(37℃和225rpm)。次日清晨，将每种培养物稀释100倍至1ml tb培养基(上图)中，然后在96孔深孔板的各个孔中孵育这些培养物5.5小时(37℃，225rpm)。(注：当存在pbad时，tb培养基中补充有0-0.02w/v％阿拉伯糖)。将100μl的每种培养物转移到标准96孔板的单个孔中，并在biotek synergy酶标仪上测量od
600
和发光(增益：135，积分时间：1秒，读取高度：1mm)。进行无细胞培养基的类似测量以测量背景信号，在计算od标准化发光(即lum/od
600
)之前从每次测量中减去这些信号。
[0136]
抗生素抗性分析。通过进行以下步骤来评价在不存在萜类途径的情况下由各种b2h系统赋予的大观霉素抗性：(i)用必要的质粒(表2)转化大肠杆菌，并将转化的细胞铺板到lb琼脂平板(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素)。(ii)单个菌落用于接种1-2ml tb培养基(12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/lkh2po4、12.53g/l k2hpo4、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素，ph＝7.0)，并将这些培养物孵育过夜(37℃，225rpm)。清晨，将每种培养物稀释100倍至含有0-500μg/ml大观霉素(大观霉素仅用于图14中描述的结果)的4ml tb培养基(如上)中，并在24孔深孔板中孵育这些培养物，至含有0μg/ml大观霉素的孔达到0.9-1.1的od
600
。(iv)将每个4-ml培养物稀释10倍至不含抗生素的tb培养基中，然后将10μl稀释液滴铺板在含有不同浓度大观霉素的琼脂平板上。(v)孵育平板过夜(37℃)并于次日进行拍照。
[0137]
为了检查萜类介导的抗性，如上所述进行步骤i和ii，在所有液体/固体介质中添加34μg/ml氯霉素和50μg/ml羧苄青霉素。然后实验进行了以下步骤：(iii)在4.5ml tb培养基(补充有12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/l kh2po4、12.53g/l k2hpo4、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素和50μg/ml羧苄青霉素)中将样品从1ml培养物稀释至od
600
＝0.05，在24孔深孔板(37℃，225rpm)中孵育。(iv)在od
600
为0.3-0.6时，将4ml每种培养物转移到24孔深孔板的新孔中，添加500μm异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)和20mm甲羟戊酸，并孵育20小时(22℃，225rpm)。(v)用tb培养基将每个4ml培养物稀释至od
600
为0.1，然后将10μl稀释剂铺板到补充有500μmiptg、20mm甲羟戊酸、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素、50μg/ml羧苄青霉素和0-1200μg/ml大观霉素的lb或tb平板上(对于两块平板，20g/l琼脂与上述培养基和缓冲液组分一起使用)。注：为控制抗生素抗性范围，ads及其突变体采用lb平板，ghs及其突变体采用提高萜类滴度的tb平板。(iv)所有平板均在30℃下进行孵育并在2天后进行拍照。
[0138]
萜类生物合成。通过用带有必需途径组分的质粒(表2)转化细胞并将它们铺板到lb琼脂平板(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠和5g/l酵母提取物，含有表2中描述的抗生素)上来制备大肠杆菌用于萜类产生。来自每个菌株的一个菌落用于接种玻璃培养管中的2ml tb(12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/l kh2po4、12.53g/l k2hpo4，ph＝7.0，含有表2中描述的抗生素)持续约16小时(37℃和225rpm)。这些培养物在10ml tb培养基中稀释75倍，在125ml玻璃摇瓶(37℃和225rpm)中孵育新培养物。在0.3-0.6的od
600
下，添加500μm iptg和20mm甲羟戊酸。生长72-88小时(22℃和225rpm)后，从每种培养物中提取萜类。
[0139]
为了测量随时间的萜类产生，使用上述方法并进行以下修改：(i)过夜培养物在4.5ml tb中以1:75ml稀释，并在玻璃培养管中添加抗生素。(ii)当培养物的od
600
达到0.3-0.6时，将4ml每种培养物移至新的培养管中，添加500μm iptg、20mm甲羟戊酸、0-800μg/ml
大观霉素和1ml十二烷(以提取萜类)。每4小时取出100μl十二烷样品进行gc/ms分析。
[0140]
蛋白质表达和纯化。如前所述表达和纯化ptp
42
。简言之，用pet21b载体转化大肠杆菌bl21(de3)细胞，并在22℃下用500μmiptg诱导20小时。通过使用脱盐、镍亲和和阴离子交换色谱(分别为hiprep 26/10、hiprep hp和hiprep q hp；ge healthcare)从细胞裂解物中纯化ptp。于-80℃在20％甘油中的hepes缓冲液(50mm，ph 7.5，0.5mm tcep)中储存最终的蛋白质(30-50μm)。
[0141]
萜类的提取和纯化。己烷用于提取液体培养中产生的萜类。对于10ml培养物，将14ml己烷添加到125ml玻璃摇瓶中的10ml培养液中，振荡(100rpm)混合物30分钟，离心(4000
×
g)，然后取出10ml己烷层进行进一步分析。对于4ml培养物，将600μl己烷添加到微量离心管中的1ml培养液中，将管涡旋3分钟，将管离心1分钟(17000
×
g)，并留出300-400μl己烷层用于进一步分析。
[0142]
为了纯化紫穗槐二烯，500-1000ml培养肉汤补充有己烷(16.7％v/v)，振荡(100rpm)混合物30分钟，用分液漏斗分离己烷层，将分离的有机相离心(4000
×
g)，取出己烷层。为了浓缩萜类产物，在旋转蒸发仪中蒸发多余的己烷，使最终体积达到500μl，并将所得混合物通过硅胶一或两次(sigma-aldrich；高纯度等级，孔径，230-400目粒径)。在gc/ms上分析洗脱级分(100％己烷)，并将级分与目的化合物(紫穗槐二烯)合并。纯化后，在温和的空气流下干燥合并的级分，将萜类固体重悬于dmso中，并按如下所述对最终样品进行定量。
[0143]
萜类的gc-ms分析。用气相色谱仪/质谱仪(gc-ms；配备tg5-silms色谱柱和isq 7000ms的trace 1310gc；thermo fisher scientific)测量液体培养中产生的萜类。所有样品均在己烷(直接或通过1:100稀释的dmso)中制备，其中20μg/ml石竹烯或松香酸甲酯作为内标。当内标的峰面积超过含仅标准物的己烷样品的平均面积的30％时，重新分析相应的样品。对于所有运行，使用以下gc方法：保持在80℃(3min)，升温至250℃(15℃/min)，保持在250℃(6min)，升温至280℃(30℃/min)，并保持在280℃(3min)。为了鉴定各种分析物，从50至550扫描m/z比。
[0144]
通过使用选择离子模式(sim)扫描分子离子(m/z＝204)来检查由ads变体产生的倍半萜烯。为了定量，我们使用eq.1：
[0145][0146][0147]
其中ai是分析物i产生的峰面积，a
std
是样品中石竹烯的c
std
产生的峰面积，并且r是参考样品中石竹烯和紫穗槐二烯的响应因子之比。
[0148]
通过使用上述程序对由ghs变体产生的倍半萜烯进行定量，并进行一些修改：松香酸甲酯用作内标(ghs的几个突变体产生石竹烯作为产物)；m/z＝204和m/z＝121，扫描倍半萜烯和松香酸甲酯之间的共同离子；使用r的m/z＝121处紫穗槐二烯和松香酸甲酯的响应因子比；在m/z＝121处计算峰面积。对于所有分析，分析侧重于面积超过m/z＝204处所有峰总面积的1％的峰。
[0149]
再次通过带有一些修改的一般程序来定量二萜类：扫描不同的分子离子(m/z＝
272)和二萜类和石竹烯共有的离子(m/z＝93)；使用m/z＝93处纯紫杉二烯(phil baran友情馈赠)和石竹烯的响应因子比；计算峰面积m/z＝93。对于所有分析，仅检查面积超过m/z＝272处所有峰总面积1％的峰。
[0150]
分子通过使用nist ms库进行鉴定，必要时，这种鉴定通过文献中报道的分析标准或质谱进行确认。注：假设不同萜类的恒定响应因子(例如，所有倍半萜烯和二萜烯分别如紫穗槐二烯和紫杉二烯电离)肯定在估计其浓度时产生误差；本文所述的分析与微生物系统中萜类产生的其他研究一致
50,51
，因此提供了除紫穗槐二烯和紫杉二烯(具有分析标准)之外的所有化合物浓度的粗略估计。
[0151]
ads和ghs的同源建模。分别使用具有针对α-红没药醇合酶(pdb条目4gax)和α-红没药烯合酶(pdb条目3sae)的结构作为模板的swiss-model来构建ads和ghs的同源模型
52
。该软件包使用promod3从靶标模板比对构建模型，其保留了保守区域的结构，并使用片段文库进行插入和缺失重新建模
53,54
。
[0152]
突变体文库的制备。通过使用位点饱和诱变(ssm)和易错pcr(epcr)制备酶突变体文库。对于ssm，进行以下步骤：(i)用靶向所选位点的nnk引物扩增基因。(ii)用dpni消化扩增的基因，用凝胶电泳纯化，然后使用gibson组装或环状聚合酶延伸克隆(cpec)
55
将它们整合到质粒(pts
xx
)中。(iii)热休克用于将完全组装的质粒转化为化学感受态neb turbo细胞。(iv)通过在几个lb(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物，50μg/ml羧苄青霉素)琼脂平板上铺板转化反应的稀释物来确定文库大小，并将所有剩余的细胞铺板在9-10个平板上用于后续分析。(v)对菌落进行测序以验证6个转化体中至少有5个含有突变基因。(vi)将平板刮入lb培养基(25g/l lb肉汤混合物，无抗生素)，并对最终的转化体进行小量制备以回收dna文库。(vii)所有最终文库均在-20℃的milliq水中冷冻。
[0153]
对于epcr，使用genemorph ii试剂盒(agilent)，具有约0.5-2.5个突变/kb。最终的质粒被透析并电穿孔到one shot电感受态top 10细胞中，按上述方法对最终的质粒进行测序、提取和储存。
[0154]
突变体文库分析。通过进行以下步骤筛选每个突变体文库：(i)对于给定的萜烯合酶，将100ng的每个位点特异性ssm文库合并。(ii)每个完整的文库(即epcr或合并的ssm)被透析2小时。(iii)将至多10μl(《1μg)的每个文库电穿孔到携带pmbis途径和b2h系统的大肠杆菌菌株中。(iv)1ml soc被添加到转化细胞中并孵育1小时(37℃和225rpm)。(v)100μl的soc生长物被连续稀释并铺板到lb琼脂平板上(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物、50μg/ml羧苄青霉素、10μg/ml四环素、50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)，并将平板孵育过夜(37℃)。该步骤实现定量筛选的转化体的数量(即通过计数菌落确定的数量)。(vi)将剩余的900μl转化细胞添加到在500ml erlenmeyer烧瓶中的100ml tb(12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/l kh2po4、12.53g/l k2hpo4、50μg/ml羧苄青霉素、10μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素，ph＝7.0中)，并孵育这些烧瓶过夜(37℃和225rpm)。(vii)清晨，在4ml tb中稀释每种培养物的等分试样至od
600
为0.05，并在玻璃培养管中进行孵育(37℃和225rpm)。(viii)在0.3-0.6的od
600
下，通过添加5-20mm甲羟戊酸和500μm iptg诱导萜类产生，并孵育所得培养物20小时(22℃和225rpm)。(ix)将每种培养物稀释至od
600
为0.001，并将100μl稀释剂铺板到含有500μm iptg、5-20mm甲羟戊酸、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素、50μg/ml羧苄青
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[0218]
实施例2
[0219]
设计抑制疾病相关蛋白的小分子代表了药物化学的长期挑战。此处，我们描述了用于将该挑战——人药物靶标的抑制——编码到微生物宿主中的方法，并用其来指导靶向的、具有生物活性的天然产物的发现和生物合成。这种方法鉴定了蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)的两种先前未知萜类抑制剂，而ptp1b是治疗糖尿病和癌症的隐蔽治疗靶点。至少一种抑制剂靶向变构位点，其赋予不同寻常的选择性；两者均可以抑制活细胞中的ptp1b。从4,464个基因池中筛选出24种未表征的萜烯合酶，发现另外的命中，证明了可扩展的发现方法，并且将不同的ptp掺入微生物宿主中会产生ptp特异性检测系统。研究结果说明了使用微生物来发现和构建具有精确定义的生化活性但具有意想不到的结构和/或结合位点的天然产物的潜力。
[0220]
尽管结构生物学和计算化学取得了进展，但设计与疾病相关蛋白质紧密且选择性结合的小分子仍然异常困难1。溶解结合配偶体的水分子中重排的自由能量贡献和结合配偶体本身的结构变化特别难以预测，因此难以纳入分子设计
2,3
。因此，药物开发通常从筛选大型化合物文库开始4。
[0221]
大自然赋予具有催化机制的生命系统，以构建种类繁多的生物活性分子——多样化的自然文库5。这些分子进化为进行重要的代谢和生态功能(例如，草食性昆虫捕食者的植物化学招募6)，但通常也表现出有用的药用特性。多年来，环境提取物和天然产物库的筛选——有时通过组合(生物)化学
7-9
来增强——发现了从阿司匹林到紫杉醇的多种治疗方法
10
。不幸的是，这些筛选往往是资源密集型
11
，受到低自然滴度
12
的限制，并且很大程度上受制于偶然性
13
。反过来，生物信息学工具允许鉴定生物合成基因簇
14,15
，其中共定位的抗性基因可以揭示其产物的生化功能
16,17
。然而，许多天然产物的治疗应用与其天然功能不同
18
，许多生物合成途径在适当重新配置时可以产生全新的，或许更有效的治疗分子
19,20
。有效鉴定和构建抑制特定疾病相关蛋白质的天然产物的方法在很大程度上仍未开发。
[0222]
蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)是一类重要的药物靶点，可以从抑制剂发现的新方法中受益。这些酶催化酪氨酸残基的水解去磷酸化，并与蛋白酪氨酸激酶(ptk)一起导致大量疾
病(例如癌症、自身免疫性疾病和心脏病等)
21,22
。过去几十年见证了许多强效ptk抑制剂的构建，这些抑制剂是30多种已批准药物的靶标
23
。相反，已证明ptp的治疗性抑制剂难以开发。这些酶具有保守的、带正电荷的活性位点，使其难以被选择性膜渗透分子抑制
24
；它们缺少任何类型的靶向治疗。
[0223]
在这项研究中，我们描述了使用微生物系统来寻找抑制难以成药的蛋白质的天然产物的方法。我们专注于蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)，它是治疗2型糖尿病、肥胖症和her2阳性乳腺癌的治疗靶点
25
。ptp1b具有通常代表ptp家族的结构特征，并调节生理过程(例如，胚胎干细胞中的能量消耗
27
、炎症
28
和神经特征
29
)的多种集合。简言之，我们组装了具有两个基因模块的大肠杆菌菌株——(i)一个模块将细胞存活与ptp1b的抑制联系起来，以及(ii)一个模块能够生物合成结构不同的萜类。在对五种充分表征的萜烯合酶的研究中，该菌株鉴定了两种先前未知的ptp1b萜类抑制剂。两种抑制剂均对ptp1b具有选择性，表现出不同的结合机制，并增加哺乳动物细胞中的胰岛素受体磷酸化。筛选来自八个系统发育不同进化枝的24种未表征的萜烯合酶，发现了另外的命中，证明了用于寻找抑制剂合成基因的可扩展方法。反过来，ptp基因的简单交换允许我们的基因编码检测系统轻松扩展到新靶标。我们的研究结果示出了使用微生物系统寻找靶向的、易于合成的疾病相关酶抑制剂的通用方法。
[0224]
开发基因编码的目标
[0225]
大肠杆菌是多功能平台，用于构建来自不可培养或低产生物体的天然产物
30,31
。我们假设经编程为检测ptp1b失活的大肠杆菌菌株(即基因编码的目标)可能能够发现抑制它的天然产物(即目标的分子解决方案)。为了对此类菌株进行编程，我们组装了细菌双杂交(b2h)系统，其中ptp1b和src激酶控制基因表达(图21a)。在该系统中，src使底物结构域磷酸化，从而实现蛋白质-蛋白质相互作用，从而激活目的基因(goi)的转录。ptp1b使底物结构域去磷酸化，阻止这种相互作用，而ptp1b的失活又使其重新启动。大肠杆菌是该检测系统的极佳宿主，因为它的蛋白质组与智人的蛋白质组足够正交，可以最大限度地减少可能由src和ptp1b的调节活动引起的脱靶生长缺陷(注1)
32
。
[0226]
我们分几个步骤进行b2h开发。首先，我们组装了发光“基础”系统，其中src调节底物结构域与src同源性2(sh2)结构域的结合(图21b)；该系统包括有助于src折叠(cdc37)
33
的分子伴侣，与检测蛋白质-蛋白质结合的其他b2h设计相似
34
。不幸的是，我们的初始系统没有产生磷酸化依赖性转录反应，因此我们用诱导型质粒——每个均携带不同的系统组分——对其进行补充，以鉴定表达水平次优的蛋白质(图21b)。有意思的是，src的二次诱导增加了发光，这表明底物磷酸化不足和/或底物-sh2结合较弱抑制我们基础系统中的goi表达。我们通过交换不同的底物结构域、通过向sh2结构域添加突变以增强其对磷酸肽的亲和力
35
以及通过去除src的该基因来修饰该系统——这种修饰使我们能够仅控制来自第二个质粒的表达。使用这种配置，src的诱导最显著地增加了针对midt底物的发光(图1c)，并且同时诱导src和ptp1b二者阻止这种增加——指示细胞内ptp1b活性(图21d)。我们通过整合ptp1b和src基因、通过调整启动子和核糖体结合位点以进一步放大其转录反应(图21d、图13和图14)以及通过添加作为goi的大观霉素抗性基因(specr)最终完成midt系统。最终的质粒携带检测系统需要ptp1b失活以允许在高浓度抗生素下生长(图21e)。
[0227]
ptp1b抑制剂的生物合成
[0228]
为了寻找在其活性位点之外结合的ptp1b抑制剂，我们将b2h系统与萜类的代谢途径相结合，萜类是一类结构多样的次级代谢物，主要具有非极性结构(图22a)，其中一些已知抑制ptp1b
36,37
。萜类包括80,000种以上已知化合物，占所有已表征天然产物(约50％的临床批准药物的基础
39
)的近三分之一
38
。首先，我们专注于没有确定的抑制作用的少数结构多样的萜类(图22b)：紫穗槐二烯(ad)、γ-葎草烯、α-红没药烯(ab)、松香二烯和紫杉二烯。每个萜类途径由两个质粒携带模块组成：(i)来自酿酒酵母的甲羟戊酸依赖性类异戊二烯途径(针对在大肠杆菌
40
中的表达进行优化)和(ii)先前已证明它可以在大肠杆菌中表达和产生五种选定的萜类中的一种的萜烯合酶
40-44
。萜烯合酶在二萜类产生需要时补充香叶基香叶基二磷酸合酶。这些模块在大肠杆菌中以0.3-18mg/l的滴度生成萜类(图26)。
[0229]
我们通过用携带目的途径和b2h系统的质粒转化大肠杆菌来筛选每种途径产生ptp1b抑制剂的能力(图22c)。令我们惊讶的是，ad和ab的途径允许在高浓度抗生素下存活。至关重要的是，gc-ms迹线证实所有途径在b2h系统存在下产生萜类(图22d，图26)，并且产生ad和ab的菌株的最大抗性需要活性萜烯合酶和功能性b2h系统(图26d)。
[0230]
我们通过检查纯化的萜类对ptp1b催化的磷酸对硝基苯酯水解(pnpp；图22e，表12)的影响证实了它们的抑制作用。在10％dmso中，ad和ab的ic
50
分别为53
±
8μm和13
±
2μm(图22f)。这些ic
50
对于小的、未官能化的碳氢化合物具有惊人的强度。两种抑制剂的配体效率均高(表15)，并且它们的效力类似于与ptp1b
21,45
形成氢键和其他稳定相互作用的较大分子的效力。两个ic
50
也与液体培养物中各自的萜类浓度相似(图22g)，这一发现与体内抑制一致(萜类倾向于在细胞内蓄积
46
，因此体内浓度可能甚至更高)。我们的生长偶联分析、动力学分析和生产测量一起表明，ad和ab通过抑制细胞内的ptp1b激活b2h系统。
[0231]
ptp1b抑制剂的生物物理分析
[0232]
ptp的变构抑制剂是药物开发的有价值的起点。这些分子在ptp的保守的、带正电荷的活性位点之外结合，并且往往具有比底物类似物
21
更高的选择性和膜渗透性。出于这些考虑，早期筛选鉴定出苯溴马隆衍生物，它对ptp1b的抑制作用较弱(ic
50
＝350μm)，且不与底物竞争。该化合物的后续优化导致结合变构位点
45
的两种改进的抑制剂(ic
50
＝8和22μm)(图23a)。在接下来的15年中，寻找与催化结构域上的这个或其他变构区域结合的新抑制剂的努力基本上没有成功
47
。苯溴马隆衍生物是唯一具有经晶体学验证的结合位点的变构抑制剂。(但与全长蛋白质的无序区域结合的变构抑制剂已经用nmr
25
进行了表征)。显然需要寻找变构抑制剂的新方法。
[0233]
我们的微生物系统可以让人们获得以意想不到的方式结合的新化合物。ad和ab提供了实例。它们是高度非极性的，因此无法参与大多数其他ptp抑制剂所依赖的氢键和静电相互作用
21,45
。为了详细检查它们的结合机制，我们试图收集与ad和α-红没药醇(ab的可溶性类似物)结合的ptp1b的x射线晶体结构(配体，由于溶解度差无法进行浸泡实验)。不幸的是，只有与ad结合的ptp1b的结构足以明确确定结合位点(图30和图31)。该抑制剂与苯溴马隆衍生物靶向的相同变构位点结合。但是，它的结合模式不同：(i)ad导致ptp1b的α7螺旋重组以产生疏水裂隙(图23b)；这种类型的重组很有趣，因为它通常很慢(微秒至毫秒)
48
并且难以纳入计算配体设计
49
。(ii)它可能采用多重结合构象(即，电子密度表示无序区域；图30)。这种由分子动力学模拟支持的行为与先前关于蛋白质与碳氢化合物部分结合的工作一致，碳氢化合物部分往往在其结合袋中“移动”。
[0234]
我们通过一些另外的分析进一步探讨了ad和ab的结合。首先，我们检测了双氢青蒿酸对ptp1b的抑制作用。ad的这种结构类似物具有羧基，根据我们的晶体结构，该羧基应该干扰与由α7螺旋产生的疏水裂隙的结合(图23c)。该分子的ic
50
比ad高8倍，效力降低与其结晶形态一致(图23d和图33)。其次，我们研究了ad与两种与活性位点结合的抑制剂之间的竞争：(i)tcs401，其导致wpd环采用闭合构象，和(ii)原钒酸盐，不会导致该结果。对于背景，苯并溴马隆在与c-末端变构位点结合后，将wpd环稳定在与tcs401的结合不相容的开放构象中，但不与原钒酸盐的结合。我们的动力学数据表明ad表现相似(图23e和图23f)，该发现与共享的结合位点和调节机制一致。最后，我们评估了ad和ab对tc-ptp(ptp1b最接近的同源物)的抑制作用。有意思的是，两种分子对tc-ptp的抑制比ptp1b弱5至6倍(图23g和图33)。这一发现同与保守性差的变构位点的结合是一致的。重要的是，这种选择性可能看起来适中，但它匹配或超过大多数预先优化的抑制剂(包括苯并溴马隆衍生物)的选择性，并且对于未官能化的碳氢化合物
50
是极为罕见的。我们依次通过从ptp1b和tc-ptp中去除等效区域来评估α7螺旋对选择性的贡献(图23g)。该修饰导致ad的选择性降低了四倍，这一效果与α7螺旋参与其结合一致。有意思的是，ab的选择性对这种修饰不敏感。明确确定该配体的结合位点需要另外的数据。
[0235]
ad和ab是亲脂性分子，其通过哺乳动物细胞膜的能力可能很有价值。为了检查这些分子的生物活性，我们将它们与hek293t/17细胞一起孵育，并使用酶联免疫吸附测定来测量胰岛素受体(ir)磷酸化的变化。ir是受体酪氨酸激酶，它从质膜的胞质侧经历ptp1b介导的去磷酸化(ptp1b反过来定位于细胞的内质网)。与阴性对照相比，两种分子都增加了ir磷酸化(图23h和图35)。我们依次通过使用等浓度的双氢青蒿酸(dihydroartimesnic acid)和α-红没药醇重复elisa，检查了对该信号的脱靶贡献。令我们满意的是，这两种分子均导致与其降低的效力一致的信号减少。
[0236]
其他ptp可以促进ir去磷酸化；shp1和shp2提供了两个实例
51-53
。为了检查这些酶对我们的elisa中观察到的ir磷酸化增加的潜在贡献，我们测量了ad和ab对它们的抑制作用。简言之，ad对shp2的抑制比对ptp1b弱三倍，并且其对shp1的抑制太弱而无法测量(图34a-34b)。ab对shp1和shp2的低效力也排除了实验测量(图34c-34d)。这些效力，连同上述对弱抑制结构类似物的分析，表明ad和ab对ptp1b的抑制是我们elisa实验中观察到的ir磷酸化增加的主要原因。
[0237]
可扩展的分子发现方法
[0238]
我们的微生物菌株提供了用于筛选基因以产生新型ptp1b抑制剂的能力的强大工具。大多数萜类，作为一个案例研究，在商业上是不可获得的，即使当它们的代谢途径是已知的，它们的生物合成、纯化和体外分析是资源密集型过程，很难与现有方法并行
54
。我们的b2h系统提供了潜在的解决方案：它可以通过简单的生长偶联分析来鉴定抑制剂合成基因。我们通过使用它筛选未表征的生物合成基因的各种集合来探索其在发现工作中的应用。简言之，我们通过构建和注释其4,464个组成成员的进化分枝图(图27)，对最大的萜烯合酶家族(pf03936)进行生物信息学分析；从此，我们从八个进化枝的每一个中合成了三个未表征的基因：六个具有未表征的基因，两个具有一些表征的基因(图24a)。我们推断，这24个系统发生不同的基因(8个来自真菌，13个来自植物，3个来自细菌)可能编码具有不同产物谱的酶，并且可能通过包含未表征的进化枝，编码新的倍半萜烯支架。
[0239]
在我们的初始筛选指导下，我们通过将每个未表征的基因与fpp途径配对来搜索倍半萜烯抑制剂。令我们惊讶的是，六个基因赋予了显著的生存优势(图24b)，并且最大抗性需要活性b2h系统(图28)。每次命中生成不同的产物谱(图29)；我们将我们的分析重点放在a0a0c9vsl7上，它主要产生作为主要产物的(+)-1(10),4-杜松二烯(图24c-24d)。这种萜类是ad的结构类似物，但效力较弱(ic
50
＝165
±
33μm；图24e)；33
±
18μm的滴度表明细胞内蓄积可能使其能够抑制细胞内的ptp1b。我们检测弱抑制剂的能力表明，b2h系统可以在分子发现工作中捕获广泛的支架。另外的命中的纯化和分析、不同大小的类异戊二烯底物的掺入(通过使用香叶基二磷酸合酶或香叶基香叶基二磷酸合酶)以及纳入更多未表征的基因可以扩展此类努力的范围。
[0240]
可选的ptp特定目标的设计
[0241]
我们通过评估b2h系统检测其他几种与疾病相关的ptp失活的能力来探索其多功能性。简言之，我们将ptp1b的基因替换为ptpn2、ptpn6或ptpn12的基因；这些酶分别是免疫治疗增强
55
、卵巢癌
56
和急性心肌梗死
57
的治疗靶标。它们的催化结构域与ptp1b的催化结构域具有31-65％的序列同一性。有趣的是，新的b2h系统立即具有功能。ptp失活允许在高浓度大观霉素下生长(图25a)。该发现表明，我们的检测系统可以很容易地扩展到ptp家族的其他成员。
[0242]
ptp特异性b2h系统可以促进鉴定选择性抑制一种ptp而非另一种的天然产物。我们通过比较ptp1b和tc-ptp特异性系统响应ad和
ɑ-红没药烯的代谢途径而赋予的抗生素抗性来探索该应用(图25b)。正如预期，ptp1b特异性系统允许在更高浓度的抗生素下生长，该结果与两种萜类对ptp1b的选择性一致。两种菌株之间无法区分的萜类滴度表明这种存活优势不是由细胞内浓度的差异引起的(图25c)。因此，研究结果表明，b2h系统的简单比较——潜在的二级筛选——提供了用于评估选择性ptp抑制基因产物的简单方法。值得注意的是，两种菌株中的高浓度抑制剂可能淹没选择性作用；在这种情况下，可通过降低甲羟戊酸浓度来降低萜类水平。
[0243]
这项研究解决了药物化学的重要挑战——设计抑制疾病相关酶的分子结构——通过使用期望的生化活性(即目标)作为遗传编码的约束来指导分子生物合成。这种方法能够鉴定ptp1b的两种选择性生物活性抑制剂，而ptp1b是隐蔽的药物靶标
58
。这些分子不是药物，但它们是用于先导开发的有希望的支架。它们的调节机制——引发变构构象变化，但似乎依赖于松散的、构象灵活的结合——是不寻常的(并且在计算上隐蔽
59
)，并证明了微生物系统有能力为分子设计中的困难挑战找到新的解决方案。反过来，我们在相对较小的文库中鉴定了不寻常的抑制剂，这表明微生物系统可以获得丰富的分子景观，而现有的分子发现方法无法有效地探索这些分子景观。
[0244]
我们方法的核心b2h系统是鉴定具有生物活性的天然产物的有价值的工具，这些天然产物结构复杂，难以合成，并且通常隐藏在隐蔽的基因簇中
60
。与当代抑制剂发现方法相比，它具有几个关键优势：(i)它包含可合成性作为搜索标准——药物先导的重要属性
61
。(ii)它是可扩展的。我们使用生长偶联测定筛选了24种未鉴定的萜烯合酶；这种类型的检测也与非常大的诱变文库(例如10
10
)
62
相容。(iii)它可以使用细胞机制来稳定蛋白质(例如，cdc37用于src)；这种能力可以促进不稳定和/或无序目标的整合。未来通过整合突变和/或重新配置的途径的大文库、替代生物合酶(例如细胞色素p450、卤化酶和甲基转移酶)
或新类别的疾病相关酶来利用这些优势的努力将是有益的。
[0245]
b2h系统也有重要的限制。当与代谢途径一起使用时，它不仅将生存与代谢物的效力联系起来，还与它们的滴度、脱靶效应和途径毒性联系起来。这些限制可能是有益的；它们将发现过程偏向于有效的、易于合成的抑制剂，因此可以有利于提高目的分子的滴度的发现后工作
63
。尽管如此，它们将排除某些类型的结构复杂的分子，这些分子难以在大肠杆菌中合成。在其他生物体(例如链霉菌)中使用基于类似活性的筛选可能是有趣的。
[0246]
我们的发现方法与不同ptp的相容性是有价值的，因为它们作为新治疗靶标
64
的丰富(且基本上未开发)来源的潜力日益得到充分验证。我们预期一些ptp将需要使用分子伴侣和/或转录调整才能纳入b2h系统。我们对基于ptp1b的系统的系统优化为探索这些修饰提供了实验框架。反过来，b2h系统的并排比较为评价二级筛选中的抑制剂选择性提供了有前景的策略。在未来的工作中，新种类的目标(例如，检测一个ptp相对于另一个ptp的选择性抑制或激活的b2h系统或遗传回路)可以促进在初步筛选中发现具有复杂调制机制的分子。基因编码目标的多功能性突出了使用微生物系统寻找靶向的生物活性分子的能力。
[0247]
注1：蛋白质组的正交性。大肠杆菌和酿酒酵母均是产生药学相关天然产物的成熟平台
20
,65
,66
。我们选择使用大肠杆菌进行这项研究，因为它的蛋白质磷酸化机制与真核细胞不同，因此不太可能干扰将ptp1b抑制与细胞生长联系起来的基因编码系统的功能
67
。相反，src激酶在酿酒酵母中的过表达是致命的，并被ptp1b减轻
68
；这些影响与我们的生化目标不一致。更广泛地，尽管酿酒酵母和人类已从共同祖先进化约10亿年
69
，但它们共享许多功能相同的蛋白质。事实上，直系同源基因占酵母基因组的超过三分之一
70
。最引人注目的是，最近的研究发现，来自酿酒酵母的414个必需基因中有近半数(47％)可以被人类直系同源基因替换而没有生长缺陷
71
。这一发现表明，对于将人类调节酶的活性的任意变化与健康优势联系起来的基因编码系统，酵母是特别受限制的宿主。
[0248]
方法
[0249]
细菌菌株。我们使用大肠杆菌dh10b、化学感受态neb turbo或电感受态one shot top10(invitrogen)进行分子克隆并对萜类的生产进行初步分析；我们使用大肠杆菌bl2-de31表达用于体外研究的蛋白质；我们使用大肠杆菌s1030
72
进行发光研究和所有涉及萜类介导生长的实验(即进化研究)。
[0250]
对于所有菌株，我们通过进行以下步骤生成化学感受态细胞：(i)我们将每个菌株铺板于含有期望的抗生素的lb琼脂平板上。(ii)我们用每种菌株的一个菌落接种1ml lb培养基(25g/l lb和表8中列出的适当抗生素)，并在玻璃培养管中培养该培养物过夜(37℃，225rpm)。(iii)我们用1ml培养物在玻璃摇瓶中接种100-300ml lb培养基(如上)，并使该培养物生长数小时(37℃，225rpm)。(iv)当培养物的od达到0.3-0.6时，我们将细胞离心(在4℃下，4,000
×
g持续10分钟)，去除上清液，将它们重悬于30ml冰冷的tfb1缓冲液(30mm乙酸钾、10mm cacl2、50mm mncl2、100mm rbcl、15％v/v甘油、水至200ml，ph＝5.8，无菌过滤)，在4℃孵育悬浮液90分钟。(v)我们重复步骤iv，但重悬于4ml冰冷的tfb2缓冲液(10mm mops、75mm cacl2、10mm rbcl2、15％甘油、水至50ml，ph＝6.5，无菌过滤)中。(iv)我们将最终的悬浮液分成100μl等分试样，并在-80℃下冷冻直至进一步使用。
[0251]
我们按照与上述类似的方法生成了电感受态细胞。然而，在步骤iv中，我们将细胞重悬于50ml冰冷的milliq水中并重复此步骤两次——首先使用50ml 20％无菌甘油(冰
冷)，然后使用1ml 20％无菌甘油(冰冷)。我们如前冷冻沉淀物。
[0252]
材料。我们从santa cruz biotechnology购买了松香酸甲酯；反式石竹烯、三(2-羧乙基)膦(tcep)、牛血清白蛋白(bsa)、m9低盐、苯甲基磺酰氟(pmsf)和dmso(二甲基亚砜)来自millipore sigma；甘油、细菌蛋白质提取试剂ii(b-perii)和溶菌酶来自vwr；克隆试剂来自new england biolabs；ad来自ambeed,inc.；以及所有其他试剂(例如抗生素和培养基组分)来自thermo fisher。紫杉二烯由the scripps research institute的phil baran友情馈赠。我们通过将1体积的2m dl-甲羟戊内酯与1.05体积的2m koh混合并在37℃下孵育该混合物30分钟来制备甲羟戊酸。
[0253]
克隆和分子生物学。我们使用标准方法(即限制性消化和连接、golden gate和gibson组装、quikchange诱变和环状聚合酶延伸克隆)构建所有质粒。表7描述了每个基因的来源；表8和表3描述了所有最终质粒的组成。
[0254]
我们通过将来自pab094a的ha4-rpoz基因整合到pab078d中并通过用卡那霉素抗性标记(gibson组装)替换pab078d的氨苄青霉素抗性标记来开始构建b2h系统。反过来，我们通过分别用激酶底物和底物识别(即sh2)结构域(gibson组装)替换ha4和sh2结构域并以各种组合(gibson组装)整合src激酶、cdc37和ptp1b的基因来修饰得到的“组合”质粒。我们通过用可增强其对磷酸肽亲和力的几个已知突变(k15l、t8v和c10a，如kaneko等人
35
中编号)修饰sh2结构域，通过将用于发光(luxab)的goi与用于大观霉素抗性(specr)的goi进行交换，并通过切换启动子和核糖体结合位点以增强转录反应(gibson组装和quickchange mutagenesis,agilent inc.)来完成功能性b2h系统。我们注意到：对于最后一步，我们还使用quikchange协议将pro1转换为prod。必要时，我们通过将b2h系统中的单一组分克隆到pbad(golden gate组装)中来构建具有阿拉伯糖诱导组分的质粒。表4、表9和表10列出了用于构建每个质粒的引物和dna片段。
[0255]
我们通过从addgene购买编码第一模块(pmbis)和各种倍半萜烯合酶(ptrc99a中的ads或ghs)的质粒并构建剩余的质粒来组装萜类生物合成的途径。我们用氯霉素抗性基因取代pmbis中的四环素抗性，从而产生了pmbisc
mr
。我们将abs、txs、aba和ggpps的基因整合到ptrc99t(即没有bsai位点的ptrc99a)中。表4、表9和表10列出了用于构建每个质粒的引物和dna片段。
[0256]
发光测定。我们用发光测定表征初步b2h系统(其含有作为goi的luxab)。简言之，我们将必要的质粒转化为大肠杆菌s1030(表8)，将转化的细胞铺板到lb琼脂平板(20g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠和5g/l酵母提取物，含有表8中所述的抗生素)，并在37℃下孵育所有平板过夜。我们使用单个菌落接种1ml极好肉汤(2％的tb、或12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、12ml/l 100％甘油、2.28g/l kh2po4、12.53g/l k2hpo4，ph＝7.3，含有表8中描述的抗生素)，我们培养这些培养物过夜(37℃和225rpm)。次日清晨，我们将每种培养物稀释100倍至1ml tb培养基(上图)中，然后在96孔深孔板的各个孔中培养这些培养物5.5小时(37℃，225rpm)。(我们注意到：当存在pbad时，我们用0-0.02w/v％阿拉伯糖补充tb培养基)。我们将100μl每种培养物转移到标准96孔透明板的单孔中，并在biotek synergy酶标仪上测量od
600
和发光(增益：135，积分时间：1秒，读取高度：1mm)。无细胞培养基的类似测量允许我们测量背景信号，我们在计算od归一化发光(即lum/od
600
)之前从每次测量中将其减去。
400μl己烷层以供进一步分析。
[0262]
为了纯化ad、ab和(+)-1(10),4-杜松二烯，我们向500-1000ml培养物中添加己烷(16.7％v/v)，振荡混合物30分钟(100rpm)，用分液漏斗分离己烷层，离心分离的有机相(4000
×
g)，并取出己烷层。为了浓缩萜类产物，我们在旋转蒸发仪中蒸发掉多余的己烷，使最终体积达到500μl，然后使所得混合物通过硅胶1-3次(sigma-aldrich；高纯度级，孔径，230-400目粒度)。我们在gc/ms上分析洗脱级分(100％己烷)，并将级分与目的化合物(ad)合并。纯化后，我们在温和的气流下干燥合并的级分，将浓缩的萜类重悬于dmso中，并对最终样品进行定量，如下所述。除非另有说明，否则我们重复纯化过程，直到样品(在dmso中)通过gc/ms纯度》95％。
[0263]
萜类的gc-ms分析。我们使用气相色谱仪/质谱仪(gc-ms；配备tg5-silms色谱柱和isq 7000ms的trace 1310gc；thermo fisher scientific)测量液体培养中产生的萜类。我们在己烷中制备所有样品(直接或通过dmso的1:100稀释)，并以20μg/ml石竹烯作为内标。在制备前将高浓度样品稀释10-20倍，以使浓度在ms检测限内。当内标的峰面积超过含有该内标的所有样品平均面积的
±
40％时，我们重新分析了相应的样品。对于所有运行，我们使用以下gc方法：保持在80℃(3min)，升温至250℃(15℃/min)，保持在250℃(6min)，升温至280℃(30℃/min)，以及保持在280℃(3min)。为了鉴定各种分析物，我们扫描了50至550的m/z比。
[0264]
我们通过使用选择离子模式(sim)扫描分子离子(m/z＝204)检查了由ads变体产生的倍半萜烯。为了定量，我们使用eq.1：
[0265][0266][0267]
其中ai是分析物i产生的峰面积，a
std
是样品中石竹烯的cstd产生的峰面积，并且r是参考样品中石竹烯和ad的响应因子之比。表11提供了该分析中使用的所有标准和参考化合物的浓度。
[0268]
我们再次通过对我们的一般程序进行一些修改来定量二萜类：我们扫描了不同的分子离子(m/z＝272)和二萜类和石竹烯共有的离子(m/z＝93)；我们使用了m/z＝93时纯紫杉二烯(phil baran的友情馈赠)和石竹烯的响应因子比率；我们计算了峰面积m/z＝93。对于所有分析，我们仅检查了在m/z＝272处面积超过所有峰总面积1％的峰。
[0269]
我们使用nist ms文库鉴定分子，并在必要时使用文献中报道的分析标准或质谱证实了这种鉴定。我们注意到：对于不同萜类的恒定响应因子的假设(即所有倍半萜烯和二萜烯分别如同ad和紫杉二烯电离的假设)肯定在估计其浓度时产生误差；我们的分析与微生物系统中萜类产生的其他研究一致
74,75
，提供了除ad和紫杉二烯(具有分析标准)之外的所有化合物的粗略估计浓度。
[0270]
生物信息学。我们使用生物信息学分析来鉴定系统发生不同的萜烯合酶的集合。简言之，我们(i)从pfam数据库下载pf03936(按c-末端结构域分组的最大萜烯合酶家族)的所有组成基因和(ii)从uniprot数据库系在酶委员会(ec)编号为4.2.3.#的所有酶；该字符串定义了作用于磷酸盐的碳氧裂解酶，包括萜烯合酶。我们在excel中清理了两个数据集
(即，我们确保每个标识符只有一行)，并且我们使用自定义r脚本将每个pf03936成员指定为已表征(即拥有基于uniprot的ec编号)或未表征。最后，我们使用带有默认设置的fasttree
76
创建pf03936家族的系统发育树，并使用r包ggtree
77
将生成的树和函数数据可视化为分枝图和热图。
[0271]
在手动注释进化分枝图后，我们从六个进化枝中的每一个中选择了三个基因：六个没有表征的基因，两个具有一些表征基因。我们避免与已知单萜烯合酶或已知作用于我们系统中不存在的ggpp异构体(例如，对苯二甲酰二磷酸)的二萜烯合酶近端的进化枝；这些酶不太可能作用于pmbis
cmr
的主要产物fpp。在进化枝内选择酶时，我们将选择偏向于细菌/真菌物种，并选择进化枝内共同祖先数量最少的基因。选择的基因由twist biosciences合成并克隆到ptrc99a载体中，并如上所述测定抗生素抗性。
[0272]
酶动力学。为了检查萜类介导的抑制作用，我们测量了在各种浓度的萜类存在下，磷酸对硝基苯酯(pnpp)或4-甲基伞形酮磷酸酯(4-mup，当pnpp的km较大时使用)的ptp催化水解。每个反应包括ptp(50mm hepes中的0.05μm ptp1b/tcptp或0.1μmshp1/shp2、0.5mm tcep、50μg/ml bsa)、pnpp(0.33、0.67、2、5、10和15mm)或4-mup(0.13、0.27、0.8、2.27、2.93、4.53、7.07和8mm)、抑制剂(浓度在图中列出)、缓冲液(50mm hepes ph＝7.3，50μg/ml bsa)和10％v/v的dmso。我们通过在spectramax m2酶标仪上每10秒测量405nm处的吸光度5分钟来监测对硝基苯酚的形成，并通过测量450nm处的荧光(370nm ex，435nm截止值，中等增益)来监测4-甲基伞形酮的形成。
[0273]
我们使用自定义matlab脚本来处理所有原始动力学数据。该脚本去除了超出(i)标准曲线范围(吸光度/荧光相对于μm；图39)或(ii)初始速率方案(》10％的pnpp或测定中使用的4-mup浓度)的所有浓度值。当这一步将动力学数据集减少到少于十个点时，我们重新测量这些数据集以收集至少十个。反过来，我们使用线性回归模型(使用matlab的反斜杠运算符)拟合最终数据集。
[0274]
我们分三个步骤评价动力学模型：(i)我们将在不存在和存在抑制剂的情况下收集的初始速率测量值分别拟合到michaelis-menten和抑制模型(此处，我们使用了来自matlab的nlinfit和fminsearch函数；表12)。(ii)我们使用f检验将混合模型与具有最小和平方误差的单参数模型进行比较(此处，我们使用matlab中的fcdf函数来分配p值)，当p《0.05时我们接受混合模型。(iii)我们使用akaike的信息准则(aic)将最佳拟合单参数模型与每个备选单参数模型进行比较，并且当对于所有比较aic(δi)的差异超过5时，我们接受“最佳拟合”模型。
78
我们注意到：对于ad、ab和(+)1-(10),4-杜松二烯，不符合此标准；然而，非竞争性和无竞争性模型均产生了无法区分的ic
50
。
[0275]
我们通过使用最佳拟合动力学模型来估计抑制剂的半数最大抑制浓度(ic
50
)，以确定15mm pnpp的ptp催化水解的初始速率降低50％所需的抑制剂浓度。我们使用matlab函数“nlparci”来确定动力学参数的置信区间，并传播这些区间以估计每个ic
50
的相应置信区间。
[0276]
x射线晶体学。我们通过使用悬滴蒸气扩散制备ptp1b晶体。简言之，我们将2μl ptp1b(约600μm ptp1b、50mm hepes，ph7.3)添加到6μl结晶溶液(100mm hepes、200mm乙酸镁和14％聚乙二醇8000，ph 7.5)中并在4℃下在结晶溶液上方孵育所得液滴一周(easyxtal crystalsupport,qiagen)。我们通过将晶体转移到由6μl结晶溶液和1μl配体溶
液(10mm在dmso中)形成的液滴中来用配体浸泡晶体，我们在4℃下孵育其2-5天。我们通过将所有配体浸泡在由缓冲液(100mm hepes、200mm乙酸镁和25％聚乙二醇8000，ph 7.5)和甘油的70/30(v/v)混合物形成的冷冻保护剂中来制备所有用于冷冻的配体。
[0277]
我们通过lawrence berkeley national lab的协作晶体学计划(als enable，光束线8.2.1、100k、)收集了x射线衍射数据。我们使用xia2软件包
79
对x射线衍射数据进行积分、缩放和合并，并使用phenix图形界面进行分子置换和结构改进
80
，辅以coot
81
中的手动模型调整以及一轮pdb-redo
82
(后者，仅用于ptp1b-ad复合物)。
[0278]
分子动力学(md)模拟。全长ptp1b含有延伸超出α7螺旋的无序区域(即299-435)。在这项研究中，我们使用了经过充分研究的包括来自无序区域的残基的截断变体(即ptp1b
1-321
)。为了模型化ptp1b，我们使用campri v.2
83
从没有无序尾的晶体结构中生成每个复合物的无序区域的结构(即ptp1b-ad的残基288-321)。为了快速热化尾部结构，我们使用absinth隐式溶剂力场
84,85
运行简短的monte carlo(mc)模拟，固定配体和蛋白质核心中原子的坐标。
[0279]
我们使用gromacs 2020
86
进行md模拟。简言之，我们使用了charmm36m蛋白质力场
87
、charmm修改的tip3p水模型
88
和cgenff
89,90
生成的配体参数。我们将每个ptp1b-配体复合物(从相应的晶体结构初始化)溶解于十二面体盒中，边缘距离复合物表面边缘距离复合物表面并且我们添加了六个钠离子来中和每个系统。我们使用lincs算法
91
来约束所有涉及氢原子的键，使用verlet跳跃算法对具有2-fs时间步长的运动方程进行数值积分，以及使用粒子网格ewald求和
92
(网格间距为0.16nm的三次插值)计算长程静电相互作用；进而我们使用1.2nm的截止波长进行短程静电和lennard-jones相互作用。我们使用改进的berendsen恒温器
93
将蛋白质-配体复合物和溶剂分子独立偶联到温度浴(300k)，其中弛豫时间为0.1ps，我们使用parrinello-rahman算法
94
将压力偶联固定到1bar，其中弛豫时间为2ps且等温压缩率为4.5
×
10-5
bar-1
。
[0280]
对于每个系统，我们进行了30次独立的md模拟以减少采样偏差。对于每个md轨迹，我们使用最陡下降法最小化能量，然后在nvt系综中使用100ps溶剂弛豫，在npt系综中使用100ps溶剂弛豫。在另外的5ns npt平衡后，我们在npt集合中进行了5ns的产生运行，并每10ps记录坐标数据。
[0281]
hek293t细胞中ptp1b抑制的分析。我们通过使细胞在含有补充了10％fbs、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素的dmem培养基的75cm2培养瓶(corning)中生长来制备了用于酶联免疫吸附测定(elisa)的hek293t/17细胞。我们每天更换培养基持续3-5天，直到细胞达到80-100％融合。
[0282]
我们通过使用ir特异性elisa(图35)测量了抑制剂对胰岛素受体(ir)磷酸化的影响。简言之，我们在不含fbs的培养基中使细胞饥饿48小时，并使其与抑制剂(均在3％dmso)一起孵育10分钟。孵育后，我们用裂解缓冲液(9803，cell signaling technology)裂解细胞，并添加1x终止磷酸酶抑制剂混合物和1x终止蛋白酶抑制剂混合物(thermo fisher scientific)10分钟，沉淀细胞碎片，并使用裂解缓冲液稀释每个样品至60mg/ml总蛋白。我们使用磷酸化胰岛素受体β(pantyr)夹心elisa试剂盒(cell signaling technology；#7082)测量了60mg/ml样品的随后稀释液中的ir磷酸化。我们注意到：为了确
定ab和ad的生物活性浓度，我们筛选了几个浓度并选择了那些产生最高信号的浓度(ab为405μm，ad为930μm)；相似浓度的弱抑制剂没有产生可检测的信号(图35b和35c)。
[0283]
统计分析和重现性。我们用双尾学生t检验(详见表14)确定了统计显著性(图23h)，并且我们使用f检验来比较抑制的一参数模型和二参数模型(表12)。
[0284]
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[0382]
表格
[0383]
表1.基因来源
[0384][0385]
表2.质粒
[0386]
[0387][0388]
*抗生素抗性：羧苄青霉素(c，50μg/ml)、卡那霉素(k，50μg/ml)、四环素(t，10μg/ml)、氯霉素(p，34μg/ml)和大观霉素(s，有条件的)。
[0389]
表3.各种b2h系统的组分。
[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
rbs使用核糖体结合位点计算器进行计算设计。
58
[0395]
表4.用于组装细菌双杂交系统的引物。
[0396]
[0397][0398]
*最初使用胰岛素受体底物/sh2结构域
59
，但未能激活操纵子(数据未显示)
[0399]
表5.用于组装萜类生物合成途径的引物。
[0400][0401]
表6.用于定点诱变的引物。
[0402]
[0403][0404]
*初始超结合体引物使不正确的赖氨酸残基(13相对于15)突变。该引物纠正该错误。用于该蛋白质的残基编号系统与kaneko等人
40
的残基编号系统相匹配。
[0405]
表7.基因来源。
[0406]
[0407][0408]
表8.质粒
[0409]
[0410]
[0411][0412]
*抗生素抗性：羧苄青霉素(c，50μg/ml)、卡那霉素(k，50μg/ml)、四环素(t，10μg/ml)、氯霉素(p，34μg/ml)和大观霉素(s，有条件)。
[0413]
+
该质粒由cold spring harbor laboratory的nicholas tonks友情馈赠。
[0414]
ag＝addgene登录号(addgene.com)。
[0415]
表9.用于组装萜类生物合成途径的引物。
[0416][0417]
表10.用于定点诱变的引物。
[0418]
[0419][0420]
*
初始超结合体引物使不正确的赖氨酸残基(13相对于15)突变。该质粒纠正该错误。用于该蛋白质的残基编号系统与kaneko等人
20
的残基编号系统相匹配。
[0421]
表11a.紫穗槐二烯/石竹烯的比例因子(m/z＝204)
[0422][0423]
*
r使用eq.2计算。标准误差显示在括号中。
[0424]
表11b.紫杉二烯/石竹烯的比例因子(m/z＝93)
[0425][0426]
表11c.紫穗槐二烯/松香酸甲酯的比例因子(m/z＝121)
[0427][0428]
表12a.紫穗槐二烯对ptp1b
1-321
抑制的分析。
[0429][0430]
*
无竞争性模型和非竞争性模型的sse无法彼此区分。
[0431]
**
表示最佳拟合模型。
[0432]
表12b.β-红没药烯对ptp1b
1-321
抑制的分析。
[0433][0434]
表12c.α红没药醇对ptp1b
1-321
抑制的分析。
[0435][0436]
表12d.双氢青蒿酸对ptp1b
1-321
抑制的分析。
[0437][0438]
表12e.紫穗槐二烯对tcptp
1-317
抑制的分析。
[0439][0440]
*
无竞争性模型和非竞争性模型的sse无法彼此区分。
[0441]
**
表示最佳拟合模型。
[0442]
表12f.α-红没药烯对tcptp
1-317
抑制的分析。
[0443][0444]
表12g.紫穗槐二烯对ptp1b
1-281
抑制的分析。
[0445][0446]
表12h.α-红没药烯对ptp1b
1-281
抑制的分析。
[0447][0448]
表12i.紫穗槐二烯对tcptp
1-281
抑制的分析。
[0449][0450]
表12j.α-红没药烯对tcptp
1-281
抑制的分析。
[0451][0452]
表12k.(+)1-(10),4-杜松二烯对ptp1b
1-321
抑制的分析
[0453][0454]
表12l.紫穗槐二烯对shp
2223-565
抑制的分析
[0455][0456]
表13.数据收集和改进统计(分子置换)
[0457][0458]
*括号中的值对应于最高分辨率层。
[0459]
**每个结构使用的晶体数量：1
[0460]
***根据图31中详述的结果，我们选择不将此结构存入蛋白质数据库。
[0461]
表14.假设检验的详细信息
[0462][0463]
表15.配体效率。
[0464][0465]
*配体效率＝(-2.303rt)/hac*log(ic
50
)，其中r是气体常数，t是以k为单位的温度，而hac是重原子数。
[0466]
其他实施方案
[0467]
本说明书中公开的所有特征可以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的可选特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或类似特征的通用系列的实例。
[0468]
通过以上描述，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求范围内。
[0469]
等同物和范围
[0470]
尽管本文已经描述和说明了若干创造性的实施方案，但是本领域的普通技术人员将容易地想到用于进行功能和/或获得结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他装置和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改被认为是在本文描述的创造性实施方案的范围内。更通常地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置均是示例性的，实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的具体应用或应用。本领域技术人员使用仅常规实验将认识到或能够确定本文描述的特定创造性实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅作为实例呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施本公开的创造性实施方案。本公开的创造性实施方案针对本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，均包括在本公开的发明范围内。
[0471]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
[0472]
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过相对于每一个所引用的主题引用并入，在一些情况下，该主题可涵盖整个文件。
[0473]
在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”，除非明确指出相反，应理解为“至少一个(种)”。
[0474]
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的要素中的“一个或两个”，即，在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应该以相同的方式解释，即这样结合的“一个或多个”要素。除了由“和/或”子句具体标识的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论是否与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言(例如“包含”)结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方案中可以仅指a(任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中，仅指b(任选地包括除a以外的要素)；在又一个实施方案中，指a和b两者(任选地包括其他要素)等等。
[0475]
如本文在说明书和权利要求书中使用的，短语“至少一个”，指的是一个或多个要素的列表，应理解为表示选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括在要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论是否与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等同地，“a或b中的至少一个”，或等同地“a和/或b中的至少一个”)可以指，在一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个a且不存在b(并且任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个b且不存在a(并且任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一种的a，以及至少一个，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其他要素)等等
[0476]
还应该理解的是，除非有明确的相反指示，本文中所要求保护的任何包括多于一个步骤或动作的方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所引用的这些步骤或动作的顺序。
[0477]
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语，例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“组成”等应被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。仅过渡短语“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”分别是封闭或半封闭过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述。

技术特征：
1.一种用于发现和进化代谢途径的方法，所述代谢途径产生调节蛋白质功能的分子，所述方法包括：使包含目的蛋白质的宿主细胞的群体与包含不同代谢途径的表达载体的群体接触，其中所述宿主细胞易于转移所述表达载体的群体；在所述宿主细胞的群体中表达所述代谢途径，其中当所述代谢途径产生调节所述目的蛋白质的产物时，所述宿主细胞的群体的细胞或子集产生可检测输出；在能够测量所述宿主细胞的群体的所述细胞或子集中的所述可检测输出的条件下筛选所述宿主细胞的群体；分离产生可检测输出的所述宿主细胞的群体的所述细胞或子集；分离在所述宿主细胞的群体的所述细胞或子集中产生比携带参考途径的参考载体的输出更高的可检测输出的表达载体，所述参考载体是例如编码不产生具有足以调节目的蛋白质活性的浓度和/或效力的分子的途径的载体；以及对由在所述宿主细胞的群体的所述细胞或子集中产生比所述参考载体的输出更高的可检测输出的所述表达载体编码的代谢途径的产物进行表征。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞包含基因编码系统，其中目的蛋白质的活性控制蛋白质复合物的组装，并因此产生与形成的复合物的量成比例的可检测输出，所述蛋白质复合物的活性是所述复合物的两种或更多种组分中的任一种不具有的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目的蛋白质是添加翻译后修饰的酶，所述翻译后修饰导致初始解离的两种蛋白质共价连接或形成非共价复合物。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述复合物由解离常数(k
d
)小于或等于sh2结构域与其磷酸化底物之间形成的复合物的k
d
的两种蛋白质形成。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述代谢途径产生苯丙素类或非核糖体肽。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述包含不同代谢途径的表达载体包含通过使起始代谢途径中的一个或多个基因突变而产生的途径文库。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述代谢途径中的一种或多种包含具有未知生物合成能力的基因的集合。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种产生与其他代谢途径的产物不同的产物。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种产生比其他代谢途径产生的产物的量更大量的产物。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种表现出比其他代谢途径更低的细胞毒性。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述代谢途径的所述产物通过标准分析方法表征，优选地通过气相色谱-质谱(gc/ms)、液相色谱-质谱(lc/ms)和/或核磁共振(nmr)波谱。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，进一步包括分离所述产物。13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括浓缩所述产物，优选地使用旋转蒸发仪。
14.根据权利要求12或13所述的方法，进一步包括测试所述产物对所述目的蛋白质的影响。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白质是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶或相关的水解酶。16.一种组合物或系统，所述组合物或系统包括包含目的蛋白质的宿主细胞的群体和包含不同代谢途径的表达载体的群体，其中当所述代谢途径产生调节所述目的蛋白质的产物时，所述宿主细胞的群体的细胞或子集产生可检测输出，任选地其中所述表达载体在所述宿主细胞的群体的所述细胞或子集中产生比携带参考途径的参考载体的输出更高的可检测输出，所述参考载体是例如编码不产生足以调节目的蛋白质活性的浓度和/或效力的分子的途径的载体。17.根据权利要求16所述的组合物或系统，其中所述宿主细胞包含基因编码系统，其中目的蛋白质的活性控制蛋白质复合物的组装，并因此产生与形成的复合物的量成比例的可检测输出，所述蛋白质复合物的活性是所述复合物的两种或更多种组分中的任一种不具有的。18.根据权利要求16或17所述的组合物或系统，其中所述目的蛋白质是添加翻译后修饰的酶，所述翻译后修饰导致初始解离的两种蛋白质共价连接或形成非共价复合物。19.根据权利要求16-18中任一项所述的组合物或系统，其中所述复合物由解离常数(k
d
)小于或等于sh2结构域与其磷酸化底物之间形成的复合物的k
d
的两种蛋白质形成。20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物或系统，其中所述代谢途径产生苯丙素类或非核糖体肽。21.根据权利要求16-20中任一项的组合物或系统，其中所述包含不同代谢途径的表达载体包含通过使起始代谢途径中的一个或多个基因突变而产生的途径文库。22.根据权利要求16-21中任一项所述的组合物或系统，其中所述代谢途径中的一种或多种包含具有未知生物合成能力的基因的集合。23.根据权利要求16-22中任一项所述的组合物或系统，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种产生与其他代谢途径的产物不同的产物。24.根据权利要求16-23中任一项所述的组合物或系统，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种产生比其他代谢途径产生的产物的量更大量的产物。25.根据权利要求16-24中任一项所述的组合物或系统，其中产生比所述参考途径的输出更高的可检测输出的所述代谢途径中的一种或多种表现出比其他代谢途径更低的细胞毒性。26.根据权利要求16-25中任一项所述的组合物或系统，其中所述目的蛋白质是泛素连接酶、sumo转移酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、糖基转移酶、棕榈酰转移酶或相关的水解酶。27.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求16-26中任一项所述的表达载体的群体。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，进一步包含如权利要求16-26中任一项所述的宿主细胞的群体。

技术总结
本公开提供了用于发现和进化代谢途径的系统、方法、试剂、装置、载体和宿主细胞，所述代谢途径产生调节酶功能的小分子。谢途径产生调节酶功能的小分子。谢途径产生调节酶功能的小分子。


技术研发人员：杰罗米
受保护的技术使用者：科罗拉多州立大学董事会（法人团体）
技术研发日：2021.01.08
技术公布日：2022/11/1