1.本发明提供一种植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物上的用途。
背景技术：2.非酒精性脂肪性肝炎(nash)是非酒精性脂肪性肝病(nafld)发生发展的重要环节，病理表现为肝细胞脂肪变性，合并小叶内炎症反应，也是进一步进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的关键因素，但其确切发病机制尚不十分清楚，亦缺乏有效治疗药物。
3.四君子汤作为传统中药组方，主要由党参、白术、茯苓、甘草四位中药组成，具有益气健脾等功能，广泛应用于临床各种消化系统疾病，现代药理学研究发现其具有防治多种肝炎的作用。有文献报道四君子汤的有效成分具有调节肠道菌群作用。肠-肝轴对许多慢性肝病的发生发展都有影响，越来越多的证据支持肠道菌群在nafld发生发展中的作用。例如，缺乏肠道菌群的小鼠对饮食诱发的肥胖症和肝脂肪变性具有抵抗力，表明肠道菌群与宿主脂质代谢密切相关。近年来，关于益生菌(probiotic)改善肠道菌群失调的证据越来越多，其可通过肠道定植抵抗、增强肠粘膜屏障，调节ph值，免疫调节功能等多种机制发挥作用。有鉴于此，本实验拟分别从体外、体内探究中药四君子汤联合益生菌(植物乳杆菌)对非酒精性脂肪性肝炎的影响及其相关的作用机制，为临床治疗肠道菌群失调和非酒精性脂肪性肝炎在内的代谢相关性疾病提供新思路。
技术实现要素：4.针对上述技术问题，本发明提供一种植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物上的用途。
5.所述的四君子汤为党参溶液、甘草溶液、白术溶液、茯苓溶液的浓度分别按浓度0.05-0.3g/ml、0.05-0.3g/ml、0.05-0.3g/ml、0.01-0.1g/ml配制的混合物。
6.所述的党参溶液的质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、或1/16g/m。
7.所述的甘草溶液的质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、1/16g/m。
8.所述的白术溶液的质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、1/16g/m。
9.所述的茯苓溶液的质量浓度为1/8g/m、1/16g/m、1/32g/m。
10.作为优选方案，所述的四君子汤为党参溶液、甘草溶液、白术溶液、茯苓溶液的浓度分别按浓度0.0625g/ml、0.25g/ml、0.0625g/ml、0.0625g/m l配制的混合物。
11.植物乳杆菌发酵四君子汤是将植物乳杆菌加入到四君子汤中进行发酵后得到的发酵液。
12.发酵条件是在35-40℃下发酵20-30h厌氧箱发酵所得到的发酵液。
13.发酵过程中，四君子汤的用量为10-15mg/g，植物乳杆菌的用量为2
×
10
9-10
cfu。
14.作为优选方案，发酵过程中所述的四君子汤的用量为13mg/g，植物乳杆菌的用量为2
×
109cfu。
15.党参溶液为党参在100℃的沸水中的提取物，再旋转蒸发得到的浸膏，将该浸膏加水调配成的党参溶液。
16.甘草溶液为甘草在100℃的沸水中的提取物，再旋转蒸发得到的浸膏，将该浸膏加水调配成的甘草溶液。
17.白术溶液为白术在100℃的沸水中的提取物，再旋转蒸发得到的浸膏，将该浸膏加水调配成的白术溶液。
18.茯苓溶液为茯苓在100℃的沸水中的提取物，再旋转蒸发得到的浸膏，将该浸膏加水调配成的茯苓溶液。
19.在上述应用过程中，本发明的植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎中的降低mda、及甘油三脂含量的药物中的应用。
20.以及在上述应用过程中，植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎中的靶向调控肝组织内mir-124-3p和elf-3含量的药物中的应用。
21.以及在上述应用过程中，植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎中降低il-β、il-6与tlr4基因表达的药物中的应用。
22.本发明的技术方案提供了植物乳杆菌发酵四君子汤lp45对非酒精性脂肪性肝炎(nash)的影响和相关作用机制。正交实验确定植物乳杆菌lp45和抗氧化活性最佳药物配比，并应用于治疗nash疾病模型。将25只8周龄c57小鼠随机分为五组：正常组(n)、模型组(m)、植物乳杆菌组(lp45,p)、四君子汤益生元组(sjzt)及合生元组(sjzt+p)。实验期间，n组给予普通饲料喂养，其余组均给予高脂饲料(hfd)喂养。同时。每日分别灌胃给予不同组小鼠对应溶液200μl：p组为lp45菌液(2x109cfu)，sjzt组为四君子汤(260mg/20g)，含植物乳杆菌lp45组为sjzt+p(sjzt：261mg/20g+lp45：2x109cfu)，n和m组为等体积生理盐水，实验周期28d。实验结束前一天禁食，采集肝脏等组织称重、检查肝脏生化和组织病理。植物乳杆菌lp45和抗氧化正交实验结果显示最佳药物配比均为党参：甘草：白术：茯苓＝1：4：1：1。体内实验结果显示，m组小鼠肝组织匀浆中丙氨酸氨基转移酶(alanine amino transferase,alt)和丙二醛(mda)均比n组显著升高；同时，肝脏组织病理显示肝细胞脂肪变性、空泡化明显，肝索排列紊乱、肝组织受损严重，提示nash造模成功。与m组相比，治疗组p、sjzt和sjzt+p的mda和甘油三酯(tg)均显著下降(p《0.05)；sjzt组的(tc)明显降低，p组的tc也降低明显(p《0.05)。肝脏组织病理结构显示治疗组的肝细胞脂肪变性明显缓解、炎性细胞浸润减少，肝小叶结构轮廓恢复。此外，sjzt+p组肝脏指数，脾脏指数也明显下调，具有统计学意义。qpcr结果显示m组tlr4和炎性因子(il-6、il-1β)表达明显升高(p《0.05)，mir-124-3p表达降低(p《0.05)，elf-3表达升高。与m组比较，治疗组tlr4和炎性因子(il-6、il-1β)表达水平均有所下降，具有统计学意义(p《0.05)，其中sjzt+p组mir-124-3p表达升高(p《0.05)，elf-3表达下调(p《0.05)。植物乳杆菌发酵四君子汤可有效改善nash小鼠的肝脂肪变性和受损，具有明显肝脏保护作用；其机制可能与mir-124-3p/elf-3靶向调控有关。
附图说明
23.图1为四君子汤益生元活性。
24.图2为四君子汤抗氧化活性。
25.图3为不同益生菌发酵四君子汤的益生元活性，作为本发明的植物乳杆菌的对照。
a：嗜酸乳杆菌la28；r：鼠李糖乳杆菌。
26.图4为小鼠日均摄食量与肝脾指数。注：n:正常组；m：模型组；p:lp45；sjzt:四君子汤组；sjzt+p:四君子汤+lp45组，n:
#
p《0.05,
##
p《0.001；m:*p《0.05,**p《0.001。a为食物摄食量，b为肝脏指数，c为脾脏指数。
27.图5为小鼠alt、mda、tg、tc含量。note：a:alt含量；b:mda含量；c：tg含量；d:tc含量，n:正常组；m：模型组；p:lp45；sjzt:四君子汤组；sjzt+p:四君子汤+lp45组，n:
#
p《0.05,
##
p《0.001；m:*p《0.05,**p《0.001。a为alt含量，b为mda含量，c为tg含量，d为tc含量。
28.图6为小鼠肝脏组织病理改变，注：n:正常组；m：模型组；p:lp45；sjzt:四君子汤组；sjzt+p:四君子汤+lp45组，n:
#
p《0.05,
##
p《0.001；m:*p《0.05,**p《0.001。
29.图7为植物乳杆菌发酵四君子汤(sjzt+p)调节小鼠mir-124-3p/elf-3表达，注：n:正常组；m：模型组；p:lp45；sjzt:四君子汤组；sjzt+p:四君子汤+lp45组，n:
#
p《0.05,
##
p《0.001；m:*p《0.05,**p《0.001。a为小鼠mir-124-3p相对表达，b为elf-3相对表达。
30.图8为qpcr检测小鼠炎症因子表达，注：n:正常组；m：模型组；p:lp45；sjzt:四君子汤组；sjzt+p:四君子汤+lp45组，n:
#
p《0.05,
##
p《0.001；m:*p《0.05,**p《0.001。a为il-1βmrna相对表达，b为il-6mrna相对表达，c为tlr4mrna相对表达。
具体实施方式
31.本发明所用的益生菌株植物乳杆菌lp45(ymc1005)(lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌la28、鼠李糖乳杆菌均购自河北一然生物科技有限公司，用mrs肉汤于厌氧罐中初步活化，再以mrs琼脂培养基分离划线，挑取单克隆进行革兰氏染色等初步鉴定后使用。37℃传代2次后于6000r/min离心15min，收集菌体并重悬至pbs溶液，计数后用于后续实验。
32.本发明所用的试剂丙二醛(malondialdehyde，mda)测定试剂盒(tba法)(a003-1-2)和丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/alt/gpt)测试盒(赖氏法)(c009-1-1)购自南京建成生物工程研究所。党参、茯苓、甘草、白术配方颗粒(广东一方制药有限公司)购于三峡大学附属仁和医院药剂科。
33.本发明进行动物试验过程中，普通饲料由三峡大学实验动物中心提供，高脂饲料(high fat feed,hfd)按比例以普通饲料53.5％：果糖20％：猪油20％：胆酸钠20％：胆固醇5％：食盐1％：胆酸钠0.5混合均匀、固定成型，辐照灭菌后备用。
34.本发明所用的统计学分析数据使用graphpad prism9.2.0进行统计学分析，采用单因素方差分析，p《0.05为差异具有显著性。
35.实施例1
36.将党参在100℃的沸水中提取3小时，得到的提取液经旋转浓缩后得到党参浸膏。
37.将甘草在100℃的沸水中提取3小时，得到的提取液经旋转浓缩后得到甘草浸膏。
38.将白术在100℃的沸水中提取3小时，得到的提取液经旋转浓缩后得到白术浸膏。
39.将茯苓在100℃的沸水中提取3小时，得到的提取液经旋转浓缩后得到茯苓浸膏。
40.将党参浸膏加水配制成质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、1/16g/m的党参溶液。
41.将甘草浸膏加水配制成质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、1/16g/m的甘草溶液。
42.将白术浸膏加水配制成质量浓度为1/4g/m、1/8g/m、1/16g/m的白术溶液。
43.将茯苓浸膏加水配制成质量浓度为1/8g/m、1/16g/m、1/32g/m的茯苓溶液。
44.四君子汤益生元和抗氧化活性均采用正交试验设计原理，设计4因素3水平表(详见表1)，3次重复实验。
45.四君子汤联合lp45菌益生元活性：
46.(1)按表1将党参、甘草、白术、茯苓配成1g/ml(生药)浓度分装-20℃储存备用；另取9个无菌ep管按表2用pbs配成9种不同浓度和比例四君子汤样品，每种药物添加量为350μl，总体积1.4ml，充分混匀后以50μl/孔，4复孔加入96孔板的实验孔；对照孔加入等体积pbs。
47.(2)将lp45菌以mrs肉汤调整浓度至od600nm＝0.01，以150μl/孔加入到上述步骤(1)的96孔板，37℃发酵培养24小时得到发酵液。
48.(3)进行测定od
600
：将步骤(2)得到的发酵液进行测定od
600
，实验孔(od
t
)、pbs对照孔(odb)，以公式计算益生元活性(％)＝[(odt-odtc)-(odb-odbc)]/(odb-odbc)*100，计算益生元活性的最佳药物配比。
[0049]
四君子汤联合lp45菌抗氧化活性：
[0050]
(1)按表1将党参、甘草、白术、茯苓配成1g/ml(生药)浓度分装-20℃储存备用；另取9个无菌ep管按表2用pbs配成9种不同浓度和比例四君子汤样品，每种药物添加量为350μl，总体积1.4ml，充分混匀后以50μl/孔，4复孔加入96孔板的实验孔；对照孔加入等体积pbs。
[0051]
(2)将lp45菌以mrs肉汤调整浓度至od600nm＝0.01，以100μl/孔加入到上述步骤(1)的96孔板，37℃下发酵培养4-6小时，后加入50μl h2o2(25μm)，继续在37℃下发酵培养12-16小时，测定od
600
：实验孔od
t
、对照孔odb，未加入h2o2孔od0。以公式计算抗氧化活性(％)＝[(od
t0-od
t
)-(od
b0-odb)]/(od
b0-odb)*100。
[0052]
表1正交实验四君子汤影响因素表
[0053][0054]
表2正交试验四君子汤样编号
[0055][0056][0057]
四君子汤联合lp45菌的益生元活性试验结果显示，不同药物促进lp45菌生长活性不同。将益生元活性数值导入正交表，获得表3的计算值，根据r值大小排序，发现对lp45菌生长影响因素的排序依次为：a(党参)》c(白术)》d(茯苓)》b(甘草)。进一步分析不同组合药物对lp45菌生长的影响，结果显示四君子汤组合配方中促进lp45菌生长的效应依次为7》8》6》9》5》4》1》3》2，即7号组合(党参：甘草：白术：茯苓＝1：4：1：1)具有最强益生元活性(图1)。
[0058]
四君子汤联合lp45菌的抗氧化活性试验结果显示，药物种类对合生元的抗氧化活性(r值排序)影响效果依次为a(党参)》c(白术)》d(茯苓)》b(甘草)(表4)，而四君子汤不同药物配比影响lp45菌的抗氧化能力依次为7》9》5》8》6》3》2》4》1，由此可见药物抗氧化的最佳组合也是7号配方(党参：甘草：白术：茯苓＝1：4：1：1)，如图2所示。
[0059]
综合上述益生元和抗氧化正交试验结果，得到复方四君子汤发酵液的抗氧化和益生元活性，以未加入药物为对照，计算益生元活性；以未加入h2o2为对照，计算药物抗氧化活性，由此可得到lp45菌发酵四君子汤可明显增加其益生元及抗氧化效果。事实上，从本技术的试验效果数据看，本技术的配方在3、4、5、6、7、8、9号的配方中都能实现优益的益生元和抗氧化效果，以配方7为最优，即党参：甘草：白术：茯苓＝1：4：1：1。即以7号样品作后续体内动物实验用药。
[0060]
表3四君子汤联合lp45菌的益生元活性试验统计结果
[0061][0062]
表4四君子汤联合lp45菌的抗氧化活性试验统计结果
[0063][0064]
采用上述的四君子汤联合益生菌的益生元活性试验检测嗜酸乳杆菌la28、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活性。其结果如图3所示。从图3可以看出，嗜酸乳杆菌la28、鼠李糖乳杆菌与四君子汤在益生元活性上均难以实现协同效果，其效果数据也不具有统计学意义。
[0065]
实施例2
[0066]
针对实施例的实验所得到的最优配方中，针对上述实施例1的7号配方的技术方案进行如下实验。
[0067]
动物饲养及处理
[0068]
25只8周龄c57小鼠由三峡大学spf级动物实验中心提供，将小鼠随机分成五组，每组5只：正常对照组(normal,n)，模型组(model,m)，植物乳杆菌组(lp45,p)，四君子汤益生元组(sjzt)，合生元组(sjzt+p)。实验期间，n组给予普通饲料喂养，其余组均给予hfd喂养。此外，不同组每日分别给予对应溶液200μl灌胃：p组为lp45菌液(2
×
109cfu)，sjzt组为四君子汤(根据实施例1的正交试验结果配制，260mg/20g)，sjzt+p组为合生元(sjzt 260mg/20g+lp45 2
×
109cfu，即将sjzt与lp45混合后在37℃下发酵24小时后得到的发酵液，经浓缩后取浓缩的发酵液含有sjzt 1.3g/ml+lp45 1
×
10
10
cfu/ml，下同)，n和m组为等体积生理盐水，实验周期28d。整个实验期间，连续监测小鼠一般状况和体重变化，并分别记录每只小鼠的体重变化，日均饮食、饮水量。
[0069]
动物组织取材
[0070]
实验结束前一天禁食，眼球取血用于tg，胆固醇测定；摘取肝脏和脾脏分别称重用于肝脾指数计算，计算公式为肝指数＝肝重(g)/体重(g)*100％，脾脏指数＝脾脏重(mg)*
10/体重(g)*100％。用生理盐水清洗干净，取适量肝脏组织固定于4％多聚甲醛，余下-80℃冻存，用于肝脏生化指标分析。组织固定24小时后常规方法程序化进行梯度脱水、石蜡包埋、切片和苏木精-伊红(he)染色，光镜镜检进行肝组织病理分析。
[0071]
小鼠一般体征观察与内脏指数
[0072]
各组小鼠摄食量差异化，与m组相比较，四组治疗均不同程度上改善了摄食量增加的症状。在给予高脂饲料的第7天部分小鼠逐渐出现毛发顺滑油腻、体重增加等症状。小鼠体重变化，m组最为明显，相对体重变化具有统计学意义(p《0.05)。小鼠肝脏、脾脏指数结果显示，模型m组肝、脾指数均显著高于正常n组(p《0.05)，差异具有统计学意义；而实验组sjzt组和sjzt+p组的脾指数较m组明显降低(p《0.05)，提示药物对小鼠免疫功能的损伤有所改善；此外，相较于m组，p组和sjzt+m组肝指数也较m组显著下降，差异均具有统计学意义(p《0.05)，提示药物对于小鼠肝脏代谢功能的损伤有一定代偿。p组的脾指数与sjzt的肝指数虽较m组有降低趋势，但差异无统计学意义(图2)。
[0073]
小鼠肝脏血清生化指标
[0074]
与n组相比，m组alt(p《0.05)、mda(p《0.001)水平均显著升高，差异具有统计学意义，提示肝功能受损、脂肪代谢紊乱。相较于m组，实验sjzt组和sjzt+p组的alt和mda水平则呈现明显降低，差异具有显著性(p《0.05)，治疗组tg均有所下降，差异具有显著性(p《0.05)，相较于m组，sjzt+p组胆固醇有一定下调，但无显著性差异(图3)。
[0075]
肝组织he染色结果及病理组织学评分
[0076]
he染色结果显示，n组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞大小均一，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝索排列整齐，肝细胞轮廓清晰。m组肝细胞呈弥漫性脂肪样变，肝索排列紊乱，肝小叶结构消失，汇管区可见炎细胞浸润明显，向小叶内延伸。实验组的肝细胞脂肪变性显著缓解、炎性细胞浸润减少，肝小叶结构轮廓恢复(图6)，采用双盲法对肝组织病理改变进行评分，以无脂肪空泡，肝组织结构完整—0分；肝细胞肿大，含少量脂滴，肝组织轮廓完整，肝小叶中心区少量炎性细胞浸润—1分；明显的脂肪空泡及肝小叶炎性细胞浸润，肝细胞坏死—2分；严重的脂肪空泡，炎症明显，肝组织结构紊乱—3分为评判标准(图4)，根据spss分析可知，治疗组均明显改善由高脂饮食导致的肝脏损伤，差异具有统计学意义。
[0077]
qpcr检测肝组织中mir-124-3p、elf-3、il-1β、il-6和tlr4表达
[0078]
取小鼠肝组织约50mg，trizol法提取小鼠肝脏组织的总rna，经逆转录试剂盒逆转录获得其cdna。以u6为内参，经qpcr反应扩增目的基因。pcr反应结束后读取ct值，利用软件opticon monitor分析，计算2
‑△△
ct分析相关基因的表达。
[0079]
小鼠肝组织中mir-124-3p/elf3靶向调控关系
[0080]
qpcr结果显示，与n组比较，m组小鼠肝组织中mir-124-3p基因表达下调，而elf-3的基因表达增加，差异有统计学意义(p《0.05)，提示在非酒精性脂肪性肝炎病变中，肝组织内mir-124-3p和elf-3可能具有调控关系；进一步分析植物乳杆菌发酵四君子汤对mir-124-3p和elf-3的影响，发现与m组比较，p与sjzt+p组mir-124-3p基因的表达明显上升，elf-3的基因表达明显下降(p《0.05)。结果提示植物乳杆菌发酵四君子汤可能具有mir-124-3p/elf-3靶向调控的作用(如图5所示)。
[0081]
小鼠肝组织中炎症相关基因的表达
[0082]
il-β和il-6为tlr4信号通路的下游。实验通过qpcr检测小鼠肝组织中il-β、il-6
与tlr4的表达情况。图6显示，与n组比较，m组中il-β、il-6与tlr4基因表达明显增加(p《0.05)；与m组比较，治疗组中il-β、il-6与tlr4基因表达均明显下降(p《0.05)，提示植物乳杆菌发酵四君子汤可能在非酒精性脂肪性肝炎的发展进程中起着一定调节作用。
技术特征：1.植物乳杆菌发酵四君子汤的发酵液在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物上的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的四君子汤为党参溶液、甘草溶液、白术溶液、茯苓溶液的浓度分别按浓度0.05-0.3g/ml、0.05-0.3g/ml、0.05-0.3g/ml、0.01-0.1g/ml配制的混合物。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的四君子汤为党参溶液、甘草溶液、白术溶液、茯苓溶液的浓度分别按浓度0.0625g/ml、0.25g/ml、0.0625g/ml、0.0625g/m l配制的混合物。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，植物乳杆菌发酵四君子汤是将植物乳杆菌加入到四君子汤中进行发酵后得到的发酵液。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，发酵条件是在35-40℃下发酵20-30h厌氧环境发酵所得到的发酵液。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，四君子汤的用量为10-15mg/g，植物乳杆菌的用量为2
×
10
9-10
cfu。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，四君子汤的用量为13mg/g，植物乳杆菌的用量为2
×
109cfu。8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，植物乳杆菌发酵四君子汤的发酵液在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的降低mda、及甘油三脂含量的药物中的应用。9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎中的靶向调控肝组织内mir-124-3p和elf-3含量的药物中的应用。10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，植物乳杆菌发酵四君子汤在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎中降低il-β、il-6与tlr4基因表达的药物中的应用。
技术总结本发明提供一种植物乳杆菌发酵四君子汤在非酒精性脂肪性肝炎上的用途。体外正交实验结果显示党参：甘草：白术：茯苓溶液的混合物通过植物乳杆菌发酵液的最佳抗氧化活性。动物实验显示模型组小鼠肝组织匀浆中丙氨酸氨基转移酶和丙二醛均比空白组显著升高。植物乳杆菌治疗组、四君子汤和联合发酵组的MDA和甘油三酯均显著下降；SJZT组的ALT和胆固醇明显降低。肝脏组织病理结构显示治疗组的肝细胞脂肪变性明显缓解、炎性细胞浸润减少，肝小叶结构轮廓恢复。SJZT+P组肝脏指数，脾脏指数也明显下调。植物乳杆菌发酵四君子汤可有效改善NASH的肝脂肪变性和受损；其机制与miR-124-3p/ELF-3靶向调控有关。靶向调控有关。
技术研发人员：周永芹 刘朝奇 汪亦婷
受保护的技术使用者：三峡大学
技术研发日：2022.07.16
技术公布日：2022/11/1
