1.本发明属于生物化学领域，具体地，本发明涉及一种对小核酸进行序列修饰的方法及其应用，更具体地，本发明涉及一种能够抑制靶基因表达的双链rna分子以及一种药物或药物组合物。
背景技术：2.rna干扰于1998年首次被发现并命名，指双链rna(dsrna)在细胞内特异性诱导与之同源的mrna降解或翻译抑制，使相应基因表达关闭，从而引发基因在转录后水平沉默。
3.在理论上，通过sirna几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而rnai受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。目前rnai研究已经成为基因功能研究和基因治疗研究的热点，特别是广泛应用于多种肿瘤及病毒感染性疾病诊断和治疗的临床前研究。
4.rna干扰(rnai)现象是生物体本身具有的调控基因表达的方式，用来描述双链rnai(dsrna)可以阻断基因的表达。rnai机制被发现以后，它在新药开发方面的潜力很快就得到了重视。因为这一机制的优点在于它可以靶向沉默基因组中的任何基因，具有强力和持久的作用机制。它不但能够解决致病蛋白“不可成药”的难题，而且可以显著降低治疗次数，提高患者用药的依从性，从而达到更好的治疗效果。
5.然而，rnai疗法在开发中也遇到了独特的挑战。这包括如何将rnai疗法靶向递送到细胞中，避免脱靶效应产生的毒副作用等等，一直是困扰rnai疗法在广大患者群体中应用的核心问题之一。
6.现有的报道表明，rnai脱靶效应的一个主要原因是与靶点mrna结合的sirna序列中的一部分片段可能起到像微rna(mirna)一样的功能，它们可以与其它mrna的3端非转录区(3
’‑
utr)相结合，抑制mrna的转译和稳定性。而mirna主要通过种子区域(5'末端的位置2-9)与靶mrna之间的碱基配对识别靶基因，由sirna引起的脱靶源自irna的反义链的种子区域与一个或多个mrna的碱基互补性。在若干个研究中已经报道了sirna中的mirna样脱靶效应，种子区域的序列能够影响多种基因的表达，并且严重到足以引起sirna的筛选结果。
7.因此，通过化学修饰来调节sirna结构，消除或降低sirna的mirna样脱靶效应，且不损害sirna的基因沉默功效，是具有重大意义的，本发明即针对这一问题。
技术实现要素：8.本发明旨在至少解决上述问题的至少之一或者提供一种可选择的商业手段。
9.为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种能够抑制靶基因表达的双链rna(dsrna)分子，该双链rna分子包含正义链和反义链，每条链具有17至40个核苷酸，其中，
10.所述反义链在5'区域的前9个核苷酸位置内包含至少一个热去稳定化修饰，所述热去稳定化修饰物为：热去稳定化修饰基团或该修饰基团的前体。
11.所述的热去稳定化修饰基团选自以下结构的基团(其中base是常见的核碱基，包
括a，t，u，g，c等)：
[0012][0013]
根据本发明实施例的双链rna分子能够显著消除或减弱rnai双链试剂或组合物的mirna样脱靶效应，有效抑制靶基因表达。
[0014]
根据本发明的实施例，上述能够抑制靶基因表达的双链rna分子还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一。
[0015]
根据本发明的实施例，所述的正义链和反义链之间，有至少19个连续互补的核苷酸对构成的双链区，并且其中所述双链rna分子的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。当所述双链rna分子的热去稳定化修饰位于所述双链区域内时，所述双链rna分子减弱了mirna样脱靶效应，可以有效抑制靶基因表达。
[0016]
根据本发明的实施例，所述热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第4-8个bp的位置。当所述热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第4-8个bp的位置时，所述双链rna分子显著降低了mirna样脱靶效应，可以有效抑制靶基因表达。
[0017]
根据本发明的实施例，所述的热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第7个bp的位置。根据本发明的一些具体实施例，当所述热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第7个bp的位置时，经过修饰的双链rna分子的mirna样脱靶效应更加弱，更有利于抑制靶基因表达。
[0018]
根据本发明的实施例，所述正义链还包含配体。根据本发明的一些具体实施例，当所述正义链中包括热去稳定化修饰和配体时，所述双链rna分子的mirna样脱靶效应减弱，同样能够有效抑制靶基因表达，且能够靶向目标受体，实现rna的递送，从而进行科学研究或对多种疾病进行干预和治疗。
[0019]
根据本发明的实施例，所述的配体是galnac配体，更优选的，所述的配体是1046、1048或1043，其结构如下所示(其中rna表示配体连接的正义链)。galnac配体与肝脏实质细胞表面的asgpr结合后，通过细胞内吞作用，进入到细胞内形成内涵体，从而将足够数量的sirna带入细胞内，诱导选择性rna沉默反应。
[0020][0021][0022]
根据本发明的实施例，所述的双链rna(dsrna)分子的解链温度为40℃～80℃。优选的，所述的解链温度为55℃～67℃。
[0023]
根据本发明的实施例，所述的双链rna(dsrna)分子在给药后的7天内，仍有至少50％的量在肝部位留存。
[0024]
在本发明的第二方面，本发明还提出了前面所述的双链rna(dsrna)分子在制备药物中的应用。根据本发明的实施例，所述的药物是治疗肝部疾病的药物。如前所述，所述双链rna分子可以有效抑制靶基因表达，且其mirna样脱靶效应更加弱，因此，本领域技术人员可以理解，包括所述双链rna分子的药物可以有效抑制各种疾病，本领域技术人员可以使用前面所述的修饰后的双链rna进行感兴趣疾病的研究，例如，当所述双链rna分子中携带galnac配体时，可以实现向肝细胞的rna递送，用于研究、治疗或缓解肝部疾病。
[0025]
根据本发明的实施例，上述双链rna(dsrna)分子在制备药物中的应用还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一。
[0026]
根据本发明的实施例，所述肝部疾病包括选自下列中的至少之一：病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病、脂肪性肝病、先天遗传代谢性肝病。所述药物性肝病是指食用损害
肝脏的药物而导致的肝脏损害性疾病，所述先天遗传代谢性肝病是指基因变异而导致肝脏代谢功能异常的一大类疾病，该类疾病发病率相对较低，不同人种患病率不同，呈家族聚集性发病，大多数是在子女遗传到同时来自父母双方的变异基因时才发病，如肝豆状核变性，肝糖原累积病、肝脏占位性病变等。
[0027]
根据本发明的实施例，所述病毒性肝炎包括：乙肝、丙肝、巨细胞病毒性肝炎或eb病毒性肝炎。
[0028]
在本发明的第三方面，本发明还提出了一种药物或药物组合物，该药物或药物组合物包含：(1)治疗有效量的所述双链rna(dsrna)分子，(2)药学上可接受的载体或赋形剂。如前所述，所述双链rna分子能够显著减少rnai双链试剂或组合物的脱靶效应，有效抑制靶基因表达，因此，进一步地，包含本发明所述双链rna分子的药物同样能够有效的抑制靶基因表达，且其脱靶效应更加弱。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]
本发明利用新型的核苷类似物，嵌入到sirna序列中。采用这种全新的修饰方法，对于具有特定基序的rnai双链体试剂以及适于治疗使用的rnai组合物而言，能够显著减少脱靶效应，并有利于抑制靶基因表达。
[0031]
本发明还提供了通过给予这些rnai双链体试剂来抑制靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病。
[0032]
本发明得到的新型核苷类似物以及新的修饰模式，对于消除或降低sirna的mirna样脱靶效应有至关重要的作用。
附图说明
[0033]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0034]
图1是根据本发明实施例4的单体修饰序列合成的操作流程示意图；
[0035]
图2-5分别是根据本发明实施例4的单体修饰序列合成中氨解后sirna-5-gna-a、sirna-5-gna-s、sirna-5-gna-an-a和sirna-5-gna-an-s的质谱检测结果图，其中，横坐标表示质荷比，纵坐标表示相对丰度(％)；
[0036]
图6-9分别是根据本发明实施例4的单体修饰序列合成中纯化后sirna-5-gna-a、sirna-5-gna-s、sirna-5-gna-an-a和sirna-5-gna-an-s的质谱检测结果图，其中，横坐标表示时间(time，min)，纵坐标表示吸光值(absorbance，mau)；
[0037]
图10和图11分别是根据本发明实施例4的单体修饰序列合成中退火后sirna-5-gna-an和sirna-5-gna的质谱检测结果图，其中，横坐标表示时间(time，min)，纵坐标表示吸光值(absorbance，mau)；
[0038]
图12和图13分别是根据本发明实施例5的sirna、单体gna或gna-an修饰的序列在gcm或gsm模式下的沉默效果检测结果图。
具体实施方式
[0039]
下面通过详细的实施例对本技术进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本技术，并不对发明内容进行限定。
[0040]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0041]
本技术中，术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地”的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。
[0042]
本技术中，术语“正义链”是指dna或rna分子上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链、有意义链或正链，而与其互补的另外一条核苷酸序列即为反义链。
[0043]
实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。
[0044]
本发明公开的化合物可以运用如下合成方法制备。
[0045]
实施例1热去稳定化修饰物的合成
[0046]
1、合成路线及修饰方法如下：
[0047][0048]
n2氛围下，在500ml干燥单颈烧瓶中，将s-环氧丙醇添加质量7.4g，浓度100mmol)溶于干燥dcm(200ml)中，加入tea(添加质量12.12g，浓度120mmol)。准确称取mscl(添加质量12.54g，浓度110mmol)，溶于干燥dcm(50ml)中，将该溶液缓慢滴加至单颈烧瓶，整个加料过程保持温度不高于10℃。
[0049]
将上述混合物于25℃下反应1小时。反应结束后，经tlc检测，原料基本消失，加入饱和nahco3溶液(100ml)淬灭，分液，有机相用饱和nahco3溶液(100ml)溶液和饱和食盐水(100ml)洗涤，洗涤后使用无水na2so4干燥，过滤浓缩得油状物粗品17.2g。
[0050]
向上述含有油状物的烧瓶中加入500ml ch3cn，称取trtnh2(添加浓度200mmol，质量52g)溶于该溶液，于室温下搅拌24h，过滤掉沉淀物trnh2/mscl，并浓缩得到油状物。加入200ml乙醇打浆，过滤，干燥得到白色固体1(质量16.5g，收率52.5％)，其中，该部分反应如下所示：
[0051][0052]
取上述获得的白色固体1质量为3.14g(10mmol)溶于100ml ch3cn中，分别加入尿嘧啶(添加质量为1.2g，浓度为11mmol)，碳酸钾(添加质量为1.7g)，于25℃反应4小时。反应结束后，经tlc检测，原料基本消失，加入饱和氯化铵溶液(50ml)淬灭，加入乙酸乙酯400ml，搅拌分液，有机相用饱和氯化铵溶液(100ml)溶液和饱和食盐水(100ml)洗涤，使用无水na2so4干燥，过滤浓缩得油状物粗品，加入500ml乙醇，重结晶，过滤，干燥得到白色固体2(获得质量2.5g，收率60.2％)，其中，该部分反应如下所示：
[0053][0054]
n2氛围下，将白色固体2(添加质量为427mg，浓度为1mmol)溶于干燥dcm(20ml)中，加入diea(添加体积为0.33ml，浓度为2.0mmol)，利用注射器缓慢滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺(添加体积为0.31ml，浓度为1.4mmol)的干燥dcm(1ml)溶液，于25℃反应1小时。反应结束后，经tlc检测，原料基本消失，加入饱和nahco3溶液(20ml)淬灭，分液，有机相用饱和nahco3溶液(20ml)溶液，饱和食盐水(20ml)洗涤，使用无水na2so4干燥，过滤浓缩得粗制品。经柱层析纯化(硅胶柱预先经1％tea/pe碱化，pe/etoac/tea＝15/1/0.1)得白色固体3(获得质量470mg，收率75％)。
[0055][0056]
化合物1
[0057]
n2氛围下，将化合物1(427mg，1mmol)溶于干燥dcm(20ml)中，加入diea(添加体积0.33ml，浓度2.0mmol)，利用注射器缓慢滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺(添加体积0.31ml，浓度1.4mmol)的干燥dcm(1ml)溶液，于25℃反应0.5小时。反应结束后，经tlc检测，原料基本消失，加入饱和nahco3溶液(20ml)淬灭，分液，有机相用饱和nahco3溶液(20ml)溶液和饱和食盐水(20ml)洗涤，使用无水na2so4干燥，过滤浓缩得粗制品。经柱层析纯化(硅胶柱预先经1％tea/pe碱化，pe/etoac/tea＝15/1/0.1)得白色固体4(获得质量489mg，收率78％)。
[0058]
实施例2热去稳定性的dsrna分子的合成
[0059]
进一步合成如下所示结构的dsrna分子，其中，1048、1046、1043为配体，所述配体连接在rna序列的5’端，其结构如下所示：
[0060][0061]
以ab、ub、gb、cb分别代表使用实施例1所述方法获得的去稳定化修饰的腺苷，尿苷，鸟苷，胞苷。
[0062]
除了上述去稳定化修饰之外，其他修饰的表述方式为：
[0063]
a表示2
’‑
o-甲基腺嘌呤核苷，u表示2
’‑
o-甲基尿嘧啶核苷，g表示2
’‑
o-甲基鸟嘌呤核苷，c表示2
’‑
o-甲基胞嘧啶核苷，af表示2
’‑
氟代腺嘌呤核苷，uf表示2
’‑
氟代尿嘧啶核苷，gf表示2
’‑
氟代鸟嘌呤核苷，cf表示2
’‑
氟代胞嘧啶核苷，a表示2
’‑
脱氧腺嘌呤核苷，t表示2
’‑
脱氧胸腺嘧啶核苷，g表示2
’‑
脱氧鸟嘌呤核苷，c表示2
’‑
脱氧胞嘧啶核苷，ao表示腺嘌呤核苷，uo表示尿嘧啶核苷，go表示鸟嘌呤核苷，co表示胞嘧啶核苷，s表示以硫代磷酸酯键连接，直接相邻的核苷酸之间没有符号，本技术获得的热去稳定化修饰物修饰的核苷酸序列及其分子量如表1-表4所示：
[0064]
表1：
[0065][0066]
表2：
[0067][0068]
表3：
[0069][0070][0071]
表4：
[0072][0073]
实施例3修饰单体gna-an及gna-an-pn的合成
[0074]
本实施例按照以下方法，合成了gna-an及gna-an-pn(gna-an亚磷酰胺单体)的一种非对映异构体，其中的合成路线如下所示：
[0075][0076]
下面是修饰单体合成的具体操作步骤：
[0077]
1、gna-an-01的合成
[0078][0079]
(1)将原料(s)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐(添加质量为12g，浓度82mmol)溶于甲醇(150ml)中，加入boc2o(添加质量为18.8g，86mmol)，降温至0℃，并缓慢滴加nahco3(添加质量为8.3g，96mmol)溶液，室温搅拌反应12h，反应结束后经lcms检测原料消失；
[0080]
(2)浓缩，加h2o(100ml)和dcm(100ml*3次)萃取，合并每次萃取获得的有机相，经饱和食盐水洗涤(100ml)后，使用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化(硅胶：添加质量为100g，200-300目；洗脱液：pe/etoac＝2/1)得gna-an-01(获得质量16.2g，收率94.3％)。
[0081]
ms(esi):m/z[m+h]
+
理论值210.1，实测值210.01。
[0082]
2、gna-an的合成
[0083][0084]
(1)将n6-苯甲酰基腺嘌呤(9.8g，41mmol)溶于dmf(100ml)中，加入nah(1.64g，41mmol)，室温搅拌反应30min，n2氛围下缓慢滴加上述获得的gna-an-z01(添加质量为8.6g，41mmol)维持70℃反应16h，反应结束后，经lcms检测原料消失；
[0085]
(2)浓缩，经反相制备(a：水+5
‰
teaa，b：acn，梯度acn:5％-20％10min,20％-45％50min)得gna-an-02(获得质量5.8g，收率34.3％)。
[0086]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.71(d,j＝1.1hz,1h),8.38(d,j＝1.0hz,1h),8.06-8.03(m,2h),7.66-762(m,2h),7.57-7.53(m,3h),6.91(d,j＝6.4hz,1h),5.75(d,j＝1.3hz,1h),4.36(dd,j＝14.0,3.4hz,2h),4.09(dd,j＝14.0,8.4hz,2h),3.91(s,1h),1.40(s,9h)。
[0087]
ms(esi):m/z[m+h]
+
理论值413.2，实测值413.02。
[0088]
将gna-an-025.5g溶于dcm50ml中，加入三氟乙酸5ml，搅拌加热至50℃，2h后，加入2m氢氧化钠溶液20ml，采用dcm50ml*3次萃取水相，合并有机相浓缩，得到化合物gna-an。ms(esi):m/z[m+h]
+
理论值313.2，实测值313.02。
[0089]
3、gna-an-pn的合成
[0090]
(1)将得到的化合物gna-an 3.13g溶于thf 40ml中，加入(boc)2o 2.3克，加入1m氢氧化钠溶液20ml，搅拌2h后，加入1m盐酸调节反应液ph值到中性，然后浓缩反应液，采用dcm 50ml*3次萃取水相，合并有机相浓缩，得到化合物gna-an-02。ms(esi):m/z[m+h]
+
理论值413.2，实测值413.02。
[0091]
(2)称取上述获得的gna-an-02(添加质量为200mg，浓度为0.485mmol)于50ml茄型瓶中，加入干燥乙腈(10ml*2)共沸，油泵抽30min，n2置换三次，随后加入干燥dcm(2ml)，干燥diea(添加体积为160μl，浓度为0.97mmol)，缓慢滴加2-氰乙基二(n-n-二异丙基)亚磷酸酯(添加质量为149mg，浓度为0.631mmol)的dcm(1ml)溶液，室温反应1.5h，tlc检测原料基本消失(硅胶板：hsgf254nm，展开剂：pe/etoac＝1/2，原料rf＝0.1，产物rf＝0.6)。
[0092]
(3)加入dcm(20ml)稀释，加入饱和nahco3(20ml)淬灭，分液，有机相用饱和nahco3(20ml)溶液，26％食盐水(20ml)洗涤，使用无水naso4干燥，过滤浓缩得粗制品。经柱层析纯化(硅胶：添加质量为20g，200-300目；洗脱液：硅胶柱预先经1％tea/pe碱化，pe/etoac＝1/2，含1％tea)得白色固体gna-an-pn(获得质量为150mg，收率50.5％，lc：91.6％)。
[0093]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ11.11(s,1h),8.71(d,j＝11.2hz,1h),8.40(d,j＝5.3hz,1h),8.05(t,j＝7.3hz,2h),7.87
–
7.34(m,4h),6.95(d,j＝17.7hz,1h),4.22(t,j＝6.6hz,1h),3.82
–
3.58(m,2h),3.20
–
2.95(m,2h),2.76(t,j＝6.0hz,1h),2.62(td,j＝6.0,2.1hz,1h),1.70
–
1.59(m,1h),1.41(d,j＝10.3hz,9h),1.27
–
1.13(m,2h),1.12
–
0.99(m,8h),0.91(t,j＝7.4hz,1h),0.80(d,j＝6.7hz,3h).
[0094]
ms(esi):m/z[m+na]
+
理论值613.3，实测值613.14。
[0095]
实施例4单体修饰序列的合成
[0096]
本实施例按照图1所示的方法进行单修饰的序列的合成。
[0097]
oligo合成是以universal-cpg为起始，使用3'-0-(2-氰乙基)亚磷酰胺/4,4'二甲氧基三苯甲基(二甲氧基三苯甲基，dmt)基团保护的方法，在固相载体(可控孔玻璃(cpg)上组装寡核苷酸链。每个合成循环都包括5'-羟基脱保护、偶联、盖帽封端和氧化(硫代)。每个偶联反应都是通过活化适当的亚磷酰胺单体并与载体固定的受保护的核苷酸或寡核苷酸的游离5'-羟基反应来进行的。按照序列信息循环合成得到相应的粗寡核苷酸单链cpg-oligo，粗寡核苷酸单链从固相载体上裂解下来，并脱除相关保护基团。然后经过制备色谱纯化，超滤脱盐，退火，冷冻干燥步骤得到终产物。
[0098]
(1)步骤一：合成
[0099]
合成路线如下所示:
[0100][0101]
合成程序包括如下单元：
[0102]
1)脱保护(de-blocking)：5`-oh端带有dmt基团(二对甲氧三苯甲基)保护的核糖核苷酸，在合成的第一步使用三氯乙酸(tca)将dmt保护基团从固相载体和核糖核苷酸上脱除，以便裸露核糖核苷酸的5`-oh偶联新的碱基。
[0103]
2)偶联(coupling)：将上述脱保护后或的核糖核苷酸(核苷酸单体)与活化试剂混合，与合成柱中cpg-oligo进行反应，活化试剂提供一个质子给3’磷酸上二异丙酰胺的n原子，形成亚磷酰胺四唑活性中间体。亚磷酰胺四唑与cpg-oligo接触时，与其5’羟基发生亲
核反应，发生偶联并脱掉四唑，延伸一个核苷酸。
[0104]
3)盖帽封端(capping)：由于偶联效率无法达到100％，为了防止未偶联成功的cpg-oligo继续进入下一步的偶联，使用cap试剂将cpg-oligo的5’羟基盖帽封端。
[0105]
4)氧化(oxidation)或者硫代：偶联反应后核苷酸通过亚磷酯键(三价磷)与cpg上的寡核苷酸相连，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，通过氧化试剂将此处三价磷氧化为五价磷。硫代是指通过硫代试剂在弱碱性条件下，将亚磷酯键的三价磷反应形成磷硫键。
[0106]
表5：合成过程中各物料名称及用量
[0107][0108]
操作具体过程如下：
[0109]
1、oligo合成仪仪器准备：检查气压delk(9.5psi)，ox/caps(9.4psi)，t/a/c/g(7.0psi)，act(7.0psi)，purge/drain(2.5psi)正常后，排空管路中气泡。
[0110]
2、编写合成文件、运行程序：将装载完毕的cpg合成柱放置在与合成操作单元相对应的blank位置。编写合成序列文件20211216-sirna-5-gna-4μmol，选取合成程序文件4μmol-500a，开始合成反义链和正义链。
[0111]
3、gna(甘油核酸亚磷酰胺)单体、gna-an亚磷酰胺单体偶联：gna和gna-an亚磷酰
胺各作为一个单体进行偶联反应。
[0112]
(2)步骤二：氨解
[0113]
表6：氨解过程中各物料名称及用量
[0114]
操作单元物料名称投料量摩尔比配比(w/w或v/w)氨解氨水：甲胺＝1：14ml\\氨解cpg-oligo4μmol*4\\氨解depc水10ml\\
[0115]
将cpg-oligo正义链和反义链从合成柱中取出，转移至可耐受压力的3ml离心管中，按照4μmol cpg-oligo加入1ml氨解液比例配制，放置在50℃
±
3℃条件下氨解0.8h。氨解结束后，室温条件下放置至管内压力降低后，转移至真空离心机中离心抽干2h，取出剩余液体。其中反义链加水稀释至3ml，正义链加水稀释至3ml，使用nanodrop检测浓度。进行质谱确认。
[0116]
质谱结果如图2-5所示，其中，图2显示sirna-5-gna-a分子量为7465.95，图3显示sirna-5-gna-s分子量为7056.88，图4显示sirna-5-gna-an-a分子量为7464.87，图5显示sirna-5-gna-an-s分子量为7056.88。
[0117]
(3)步骤三：纯化
[0118]
氨解稀释后的样品采用阴离子柱交换色谱进行纯化，液相系统采用高效液相色谱，色谱条件如下。
[0119]
色谱柱：bondysil ps-15q 10*250mm
[0120]
流速：5ml/min
[0121]
检测波长：260nm
[0122]
离子柱制备纯化梯度程序：
[0123]
流动相：a相：10mm pb(ph＝8.0)+2m nacl b相：10mm pb(ph＝8.0)
[0124]
表7
[0125][0126][0127]
操作过程如下：
[0128]
1、制备纯化使用流动相配置：
[0129]
a相：称取十二水合磷酸氢二钠13.57g，二水合磷酸二氢钠0.33g，氯化钠224g，加入4l水溶解，超声10min。
[0130]
b相：称取十二水合磷酸氢二钠13.57g，二水合磷酸二氢钠0.33g，加入4l水溶解，超声10min。
[0131]
2、平衡系统：使用90％b相冲洗色谱柱10min，30％a相平衡色谱柱10min至基线稳定。
[0132]
3、制备纯化：采用阴离子柱ps-15q进行纯化，样品上样结束后，运行预设的离子柱
制备纯化梯度程序并收集馏分进行中控分析，馏分纯度低于90％。
[0133]
纯化结果如图6-9所示，其中，图6显示sirna-5-gna-a(反义链)纯度为91.06％，图7显示sirna-5-gna-s(正义链)纯度为94.35％，图8显示sirna-5gna-an-a(反义链)纯度为88.55％，图9显示sirna-5-gna-an-s(正义链)纯度为90.53％。
[0134]
(4)步骤四：超滤
[0135]
纯化后得到的样品，加入去除rnase水4ml溶解，转移至15ml 1k超滤管中，以5000r/min转速离心45min，然后使用nanodrop检测离心管内液体是否存在样品，若于260nm波长条件下检测含有样品则说明超滤膜破损，需更换超滤管，重新超滤；若260nm波长条件下检测不含有样品，补加4ml rnase水再次超滤。超滤3次，每次45min。最后使用nanodrop检测超滤管内样品浓度。sirna-5-gna-s(正义链)浓度为3306.4ng/μl，sirna-5-gna-a(反义链)浓度为2772.1ng/μl，sirna-5gna-an-a(反义链)浓度为1018.5ng/μl，sirna-5gna-an-s(正义链)浓度为3024.2ng/μl。
[0136]
(5)步骤五：退火
[0137]
正义链和反义链超滤结束后，分别以3mg/ml的浓度稀释样品，按照1：1的摩尔比混合正义链和反义链。水浴锅加热至90℃，将按比例混合后的正义链和反义链放置水浴锅内，退火30min。关闭水浴锅，自然降至室温16h。取样10μl进行hplc检测。并且将样品进行冻干备用。其中，sirna-5-gna获得质量为1.8mg，sirna-5-gna-an获得质量为7.6mg。
[0138]
hplc的检测结果如图10和11所示，其中，图10显示sirna-5-gna-an纯度为88.80％，图11显示sirna-5-gna纯度为92.61％。
[0139]
实施例5单体gna-an修饰序列的沉默效果检测
[0140]
本实施例利用荧光报告素酶系统，在hek293细胞中评价序列脱靶效应。针对受试序列sirna-5(具体序列如表8所示)构建重组质粒，检测在靶活性及反义链种子区脱靶活性。其中，在靶活性检测质粒中插入与受试sirna反义链核苷酸序列完全互补的序列；反义链种子区脱靶活性检测质粒插入序列单元与受试sirna反义链的种子区(5’端起2-8位)完全互补，其余位置序列完全不互补(a:c；t:g；g:t；c:a)，插入3个重复序列单元。目标序列克隆到psicheck
tm-2质粒xho 1/not 1位点，插入序列信息如下：sirna5-gcm：gaatgtgaaagtcatcgacaa(seq id no:13)，sirna5-gsm：tccgtgtccctgaatcgacaatccgtgtccctgaatcgacaatccgtgtccctgaatcgacaa(seq id no:14)。
[0141]
hek293(atcc)细胞培养于添加10％fbs(gibco)的dmem(gibco)培养基中。转染前一天以每孔15000个细胞的密度接种于96孔板，贴壁后转染。转染过程参照lipofectemine2000(thermofisher)说明书标准流程。转染体系包括0.2μl lipofectemine2000/10ng质粒/孔，及选定剂量的sirna受试物，每个转染条件设置3个平行孔。转染24小时后，使用dual-glo@luciferase assay system(promega e2940)按说明书标准流程检测双荧光素酶。检测结果，以无添加sirna作为对照组，该组“海肾荧光发光值/萤火虫荧光发光值”设定为100％。其他各浓度组“海肾荧光发光值/萤火虫荧光发光值”与对照组数据比较得到相对的发光值。
[0142]
检测序列信息如表8所示：
[0143]
表8：
[0144][0145][0146]
其中，*表示硫代的磷酸二酯
[0147]
具体的实验结果如图12-13以及表9所示，其中，(1)gna或gna-an单体修饰后，没有观察到sirna在靶活性(gcm)降低的现象；(2)gna或gna-an单体修饰后，显著改善sirna脱靶活性(gsm)；(3)新单体gna-an与gna表现基本一致。
[0148]
表9：
[0149]
ec50(nm)sirna-5sirna-5gnasirna-5gna-angcm0.037240.019830.001473gsm0.92914.53～
[0150]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0151]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
技术特征：1.一种能够抑制靶基因表达的双链rna分子，该双链rna分子包含正义链和反义链，每条链分别具有17至40个核苷酸，其特征在于，所述反义链在5'区域的前9个核苷酸位置内，包含至少一个热去稳定化修饰，所述热去稳定化修饰物为：热去稳定化修饰基团或该修饰基团的前体；所述的热去稳定化修饰基团选自以下结构的基团，其中，所述基团中的base包括a，t，u，g，c碱基中的一种：2.根据权利要求1所述的双链rna分子，其特征在于，所述的正义链和反义链之间，有至少19个连续互补的核苷酸对构成的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。3.根据权利要求1或2所述的双链rna分子，其特征在于，所述的热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第4-8个bp的位置；更优选的，所述的热去稳定化修饰位于所述反义链的5
′
区域的第7个bp的位置。4.根据权利要求1～3任一所述的双链rna分子，其特征在于，所述的双链rna分子的解链温度为40℃～80℃；优选的，所述的解链温度为55℃～67℃。5.一种药物或药物组合物，该药物或药物组合物包含：(1)治疗有效量的权利要求1～6任一所述的双链rna分子；(2)药学上可接受的载体或赋形剂。
技术总结本发明涉及一种对小核酸进行序列修饰的方法及其应用，使用热去稳定化修饰物修饰双链RNA分子反义链在5'区域的前9个核苷酸(bp)位置内的至少一个碱基，以改善该双链RNA分子的热稳定性。优选的，所述的双链RNA分子正义链和反义链之间，有至少19个连续互补的核苷酸对构成的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。本发明还涉及所述的修饰后的小核酸在制备药物中的应用。本发明所述的方法对于具有特定基序的RNAi双链体试剂以及适于治疗使用的RNAi组合物而言，能够显著减少脱靶效应，并有利于抑制靶基因表达，为疾病的治疗提供理论基础。的治疗提供理论基础。
技术研发人员：刘兆贵 张捷婷 赵维峰 丁彦伟 陈璞
受保护的技术使用者：纳肽得有限公司
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/11/1
