1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法。
背景技术：2.细菌素是某些细菌(包括乳酸菌)在代谢过程合成的具有抑菌活性的蛋白质或多肽类的物质。不同细菌素的分子量大小、热稳定性强弱和修饰氨基酸的有无大不相同，一般来说，细菌素可以分为四种类型：1、羊毛硫抗生素；2、热稳定小分子肽；3、热不稳定大分子蛋白；4、类蛋白复合体。宋诙等(中国专利201910384922.x)发现植物乳杆菌cgmcc5297所产抗菌肽对单核细胞增生李斯特氏菌(革兰氏阳性致病菌)具有极强的抑制作用。陆健等(中国专利201610728511.4)使用一种乳酸片球菌，其能产生乳酸菌素r16，属于抗菌六肽(细菌素)，对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性致病菌)均有抑制作用，能够有效降低豆粕中大肠杆菌的数量，此外，该乳酸片球菌对益生菌植物乳杆菌具有一定的促进增殖作用。邴双飞等(硕士论文，唾液乳杆菌zdy159a抑菌机制及其合生元微胶囊的初步研究)阐述唾液乳杆菌zdy159a对金黄色葡萄球菌cmcc26003(革兰氏阳性模式致病菌株)和大肠杆菌o157：h7 nctc12900(革兰氏阴性模式致病菌株)有较强的抑菌作用的现象，该菌主要通过发酵过程中产生的有机酸、细菌素(蛋白或多肽类物质)和过氧化氢来抑制致病菌。
3.目前的非成芽孢乳酸菌的菌粉的制备工艺主要分为以下5个步骤：s1、菌株活化及扩培；s2、厌氧发酵；s3、菌体收集及乳化；s4、将乳化液冻干；s5、粉碎后包装。s2步骤中使用了发酵培养基进行厌氧发酵，发酵培养基以公知的mmrs培养基或其改良配方为主，其中mmrs培养基配方：蛋白胨1％、牛肉浸膏(或牛肉浸粉)1％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、乙酸钠0.5％、七水硫酸镁0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸氢二铵0.2％、一水合硫酸锰0.025％，吐温800.01、与半胱氨酸0.05％，培养基121℃灭菌20min。s3步骤中的乳化阶段指将菌体和冻干保护剂进行均质化,行业公知的冻干保护剂通常含有脱脂乳和(或)乳糖。如李珮铷(中国专利202011082982.5)采用含有脱脂乳和乳糖的冻干保护剂体(16％脱脂乳，10％糊精，4％聚乙烯吡咯烷酮，6％乳糖，0.5％谷氨酸钠，0.5％半胱氨酸，0.3-0.8％乙酸钠，其余为水)对唾液乳杆菌ger106进行冻干保护。s2步骤中，使用了蛋白胨和牛肉浸膏(或牛肉浸粉)作为氮源供菌体生长，其最终冻干菌粉可能不能符合清真认证(halal认证)，不适宜所有人群。s3步骤中，使用了脱脂乳和乳糖提供冻干保护，虽然能保证冻干过程中菌体的存活率，但脱脂乳和乳糖是一种公认的过敏源，不适合所有人群。
4.cn106244509a开发了一种鼠李糖乳杆菌培养基，具有基础培养基和优化培养基，基础培养基包括组分：酵母蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物、乙酸钠、硫酸镁、吐温80、低聚异麦芽糖、磷酸二氢钾、余量为无菌水，ph值6.20～6.80；优化培养基包括组分：酵母蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物、乙酸钠、硫酸镁、吐温80、低聚异麦芽糖、磷酸二氢钾、余量为无菌水，ph值6.20～6.80。该培养基适于鼠李糖乳杆菌的繁殖培养，虽然其不含过敏原蛋白胨1％、牛
肉浸膏牛肉浸粉等，但用该培养基制备得到的菌粉中活菌数、稳定性及抗菌活性较差。
5.因此，亟待开发一种不含过敏原，且能够提高菌粉活菌数、稳定性及菌体抗菌活性增强的冻干粉的制备方法。
技术实现要素：6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法。所述制备方法能够很好地避免使乳糖不耐受群体使用后发生过敏反应，且使用本发明所述制备方法制备得到的鼠李糖乳杆菌冻干粉具有菌粉活菌数提高、储存稳定性提高、分散溶解性加强和菌体抗菌活性增强等诸多优点。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9.(1)种子培养：将鼠李糖乳杆菌lra05扩培三代后，再接种至含种子培养基的发酵罐中，培养至发酵液的od
600
≥2.5，得到种子液；
10.其中，所述种子培养基的氮源包括酵母蛋白胨和酵母浸粉；
11.(2)发酵培养：将步骤(1)得到的种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，进行培养，长至对数生长期后期降温，且所述降温的过程中控制发酵液的ph为5.8～6.0(例如可以是5.8、5.9、6.0等)，离心收集，得到菌泥；
12.其中，所述发酵培养基的氮源包括酵母蛋白胨和酵母浸粉；
13.(3)冻干：将步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，冷冻干燥，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
14.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖115～125g/l、麦芽糊精35～45g/l、甘油25～35g/l和酵母细胞95～105g/l。
15.在本发明中，首先，通过调整种子培养基和发酵培养基的组成，以及培养的参数条件，使得厌氧发酵阶段不使用蛋白胨(动物源)和牛肉浸粉(浸膏)，所述含种子培养基和发酵培养基的氮源均包括酵母蛋白胨和酵母浸粉；从而可以符合清真认证(halal认证)；且菌体收集及乳化阶段不使用乳糖、脱脂奶粉，从而避免使乳糖不耐受群体使用后发生过敏反应。
16.其次，所述发酵培养的过程中，长至对数生长期后期降温时持续控碱以维持发酵液ph，其原因是为了尽量减小菌体环境的变化导致的菌体死亡及对冻干的影响，从而达到进一步提高制备得到菌粉的活菌数和稳定性。的目的。
17.最后，本发明采用上述特定配比的海藻糖、麦芽糊精、甘油和酵母细胞，这四种组分相互配合，具有协同增效的作用，能够和菌株形成交联和包埋支撑，有利于快速冻干，且使得所得的冻干菌粉更具以下特点：
①
菌粉活菌数提高，
②
菌粉储存稳定性提高，
③
菌粉分散溶解性加强，
④
菌体抗菌活性增强。
18.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖115～125g/l、麦芽糊精35～45g/l、甘油25～35g/l和酵母细胞95～105g/l。
19.所述复合保护剂中，海藻糖的含量为115～125g/l，例如可以是115g/l、116g/l、117g/l、118g/l、119g/l、120g/l、121g/l、122g/l、123g/l、124g/l、125g/l等。
20.所述复合保护剂中，麦芽糊精的含量为35～45g/l，例如可以是35g/l、36g/l、37g/l、38g/l、39g/l、40g/l、41g/l、42g/l、43g/l、44g/l、45g/l等。
21.所述复合保护剂中，甘油的含量为25～35g/l，例如可以是25g/l、26g/l、27g/l、28g/l、29g/l、30g/l、31g/l、32g/l、33g/l、34g/l、35g/l等。
22.所述复合保护剂中，酵母细胞的含量为95～105g/l，例如可以是95g/l、96g/l、97g/l、98g/l、99g/l、100g/l、101g/l、102g/l、103g/l、104g/l、105g/l等。
23.在本发明中，步骤(1)中，所述鼠李糖乳杆菌lra05为鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus lra05菌株，保藏编号为cgmcc no.1.12734，保藏日期为2020年7月20日。
24.其保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
25.优选地，步骤(1)中，所述扩培三代的具体步骤为：按接种量为1-3％(例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％等)的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代。
26.优选地，所述扩培三代的具体参数为：一代于5～15ml(例如可以是5ml、6ml、8ml、10ml、12ml、14ml、15ml等)的试管中36～38℃(例如可以是36℃、37℃、38℃等)培养9～11h(例如可以是9h、9.5h、10h、10.5h、11h等)；二代于250～350ml(例如可以是250ml、300ml、350ml等)锥形瓶中36～38℃(例如可以是36℃、37℃、38℃等)培养9～11h(例如可以是9h、9.5h、10h、10.5h、11h等)；三代于2.5～3.5l(例如可以是2.5l、3l、3.5l等)锥形瓶中36～38℃(例如可以是36℃、37℃、38℃等)培养5～7h(例如可以是5h、5.5h、6h、6.5h、7h等)。
27.优选地，所述种子培养基包括：酵母蛋白胨8～12g/l、酵母浸粉8～12g/l、葡萄糖18～22g/l、乙酸钠0.4～0.6g/l、柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/l、k2hpo4
·
3h2o 1.8～2.2g/l、mgso4·
7h2o 0.05～0.2g/l、mnso40.04～0.06g/l、吐温-80 0.8～1.2ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6g/l。
28.所述种子培养基中，酵母蛋白胨的含量为8～12g/l，例如可以是8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l、10g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l等。
29.所述种子培养基中，酵母浸粉的含量为8～12g/l，例如可以是8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l、10g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l等。
30.所述种子培养基中，葡萄糖的含量为18～22g/l，例如可以是18g/l、18.5g/l、19g/l、19.5g/l、20g/l、20.5g/l、21g/l、21.5g/l、22g/l等。
31.所述种子培养基中，乙酸钠的含量为0.4～0.6g/l，例如可以是0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l等。
32.所述种子培养基中，柠檬酸氢二铵的含量为1.8～2.2g/l，例如可以是1.8g/l、1.9g/l、2.0g/l、2.1g/l、2.2g/l等。
33.所述种子培养基中，k2hpo4
·
3h2o的含量为1.8～2.2g/l，例如可以是1.8g/l、1.9g/l、2.0g/l、2.1g/l、2.2g/l等。
34.所述种子培养基中，mgso4·
7h2o的含量为0.05～0.2g/l，例如可以是0.05g/l、0.06g/l、0.08g/l、0.1g/l、0.12g/l、0.15g/l、0.18g/l、0.2g/l等。
35.所述种子培养基中，mnso4的含量为0.04～0.06g/l，例如可以是0.04g/l、0.045g/l、0.05g/l、0.055g/l、0.06g/l等。
36.所述种子培养基中，吐温-80的含量为0.8～1.2ml/l，例如可以是0.8ml/l、0.9ml/l、1.0ml/l、1.1ml/l、1.2ml/l等。
37.所述种子培养基中，半胱氨酸盐酸盐的含量为0.4～0.6g/l，例如可以是0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l等。
38.优选地，步骤(1)中，所述种子培养的具体步骤为：将鼠李糖乳杆菌lra05扩培三代后，再按接种量为1-3％(例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％等)的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于36～38℃(例如可以是36℃、37℃、38℃等)下培养4～6h(例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h、6h等)，培养至发酵液的od
600
≥2.5(例如可以是2.5、2.6、2.8、3、3.2等)，得到种子液。
39.优选地，步骤(2)中，所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖38-42g/l、乙酸钠0.4-0.6g/l、柠檬酸氢二铵1.8-2.2g/l、k2hpo4·
3h2o 1.8-2.2g/l、mgso4·
7h2o 0.05-0.2g/l、mnso4 0.04-0.06g/l、吐温-80 0.8-1.2ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.6g/l。
40.所述发酵培养基中，酵母蛋白胨的含量为8～12g/l，例如可以是8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l、10g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l等。
41.所述发酵培养基中，酵母浸粉的含量为8～12g/l，例如可以是8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l、10g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l等。
42.所述发酵培养基中，葡萄糖的含量为38-42g/l，例如可以是38g/l、38.5g/l、39g/l、39.5g/l、40g/l、40.5g/l、41g/l、41.5g/l、42g/l等。
43.所述发酵培养基中，乙酸钠的含量为0.4～0.6g/l，例如可以是0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l等。
44.所述发酵培养基中，柠檬酸氢二铵的含量为1.8～2.2g/l，例如可以是1.8g/l、1.9g/l、2.0g/l、2.1g/l、2.2g/l等。
45.所述发酵培养基中，k2hpo4
·
3h2o的含量为1.8～2.2g/l，例如可以是1.8g/l、1.9g/l、2.0g/l、2.1g/l、2.2g/l等。
46.所述发酵培养基中，mgso4·
7h2o的含量为0.05～0.2g/l，例如可以是0.05g/l、0.06g/l、0.08g/l、0.1g/l、0.12g/l、0.15g/l、0.18g/l、0.2g/l等。
47.所述发酵培养基中，mnso4的含量为0.04～0.06g/l，例如可以是0.04g/l、0.045g/l、0.05g/l、0.055g/l、0.06g/l等。
48.所述发酵培养基中，吐温-80的含量为0.8～1.2ml/l，例如可以是0.8ml/l、0.9ml/l、1.0ml/l、1.1ml/l、1.2ml/l等。
49.所述发酵培养基中，半胱氨酸盐酸盐的含量为0.4～0.6g/l，例如可以是0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l等。
50.优选地，步骤(2)中，所述培养的具体步骤为：按接种量为1-3％(例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％等)的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于36～38℃(例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等)培养10～12h(例如可以是10h、10.5h、11h、11.5h、12h等)后长至对数生长期后期后，再以0.3～0.5℃/min(例如可以是0.3℃/min、0.35℃/min、0.4℃/min、0.45℃/min、0.5℃/min等)的速率降温至25～28℃(例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃等)，且所述降温的过程中采用20～30wt％(例如可以是
20wt％、22wt％、24wt％、26wt％、28wt％、30wt％等)的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.7～5.9(例如可以是5.7、5.8、5.9等)。
51.优选地，步骤(2)中，所述离心收集的温度为25～28℃(例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃等)，所述离心收集的转速为10000～14000rpm(例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm等)，所述离心收集的时间为150～180min(例如可以是150min、160min、170min、180min等)。
52.优选地，步骤(3)中，所述菌泥和复合保护剂的质量比为(0.8-1.2):1，例如可以是0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1、1:1、1.1:1、1.2:1等；
53.优选地，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-25℃(例如可以是-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃等)，所述冷冻干燥的时间为36～40h(例如可以是36h、37h、38h、39h、40h等)。
54.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
55.(1)冻干菌粉制作过程中，厌氧发酵阶段不使用蛋白胨(动物源)和牛肉浸粉(浸膏)，从而可以符合清真认证(halal认证)；菌体收集及乳化阶段不使用乳糖、脱脂奶粉，从而避免使乳糖不耐受群体使用后发生过敏反应；
56.(2)使用本工艺配方生产所得的冻干菌粉，
①
菌粉活菌数提高，
②
菌粉储存稳定性提高，
③
菌粉分散溶解性加强，
④
菌体抗菌活性增强。
具体实施方式
57.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
58.应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
59.本发明采用的各菌种信息如下所示：所述鼠李糖乳杆菌lra05为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)lra05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为cgmcc no.1.12734，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
60.本技术采用的酵母细胞具体来源为：购自于安琪型号为yp100的产品。
61.实施例1
62.本实施例提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
63.(1)种子培养：按接种量为2％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代，所述扩培三代的具体参数为：一代于10ml的试管中37℃培养10h；二代于300ml锥形瓶中7℃培养10h；三代于3l锥形瓶中37℃培养6h；再按接种量为2％的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于37℃下培养4h，培养至发酵液的od
600
为2.5，得到种子液；
64.所述种子培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4
·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso40.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
65.(2)发酵培养：按接种量为2％的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于37℃培养12h后长至对数生长期后期后，再以0.5℃/min的速率降温至25℃，且所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.8，最后于25℃下以10000rpm的转速离心收集150min，得到菌泥；
66.所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖40g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4 0.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
67.(3)冻干：将质量比为1:1的步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，于-25℃冷冻干燥40h，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
68.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖120g/l、麦芽糊精40g/l、甘油30g/l和酵母细胞100g/l。
69.实施例2
70.本实施例提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
71.(1)种子培养：按接种量为2％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代，所述扩培三代的具体参数为：一代于10ml的试管中37℃培养10h；二代于300ml锥形瓶中7℃培养10h；三代于3l锥形瓶中37℃培养6h；再按接种量为2％的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于37℃下培养5h，培养至发酵液的od
600
为2.7，得到种子液；
72.所述种子培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4
·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso40.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
73.(2)发酵培养：按接种量为2％的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于37℃培养11.5h后长至对数生长期后期后，再以0.4℃/min的速率降温至25℃，且所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.7，最后于25℃下以10000rpm的转速离心收集150min，得到菌泥；
74.所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖40g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4 0.05 g/l、吐温-801.0ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
75.(3)冻干：将质量比为1:1的步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，于-40℃冷冻干燥40h，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
76.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖118g/l、麦芽糊精42g/l、甘油28g/l和酵母细胞102g/l。
77.实施例3
78.本实施例提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
79.(1)种子培养：按接种量为2％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代，所述扩培三代的具体参数为：一代于10ml的试管中37℃培养10h；二代于300ml锥形瓶中7℃培养10h；三代于3l锥形瓶中37℃培养6h；再按接种量为2％的体积
百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于37℃下培养6h，培养至发酵液的od
600
为2.6，得到种子液；
80.所述种子培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso40.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
81.(2)发酵培养：按接种量为2％的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于37℃培养11h后长至对数生长期后期后，再以0.3℃/min的速率降温至25℃，且所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.9，最后于25℃下以10000rpm的转速离心收集150min，得到菌泥；
82.所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖40g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4 0.05 g/l、吐温-801.0ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
83.(3)冻干：将质量比为1:1的步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，于-40℃冷冻干燥36h，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
84.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖122g/l、麦芽糊精38g/l、甘油32g/l和酵母细胞98g/l。
85.实施例4
86.本实施例提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
87.(1)种子培养：按接种量为2％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代，所述扩培三代的具体参数为：一代于10ml的试管中37℃培养10h；二代于300ml锥形瓶中7℃培养10h；三代于3l锥形瓶中37℃培养6h；再按接种量为2％的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于37℃下培养4h，培养至发酵液的od
600
为2.5，得到种子液；
88.所述种子培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4
·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso40.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
89.(2)发酵培养：按接种量为2％的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于37℃培养12h后长至对数生长期后期后，再以0.5℃/min的速率降温至25℃，且所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为6.0，最后于25℃下以10000rpm的转速离心收集150min，得到菌泥；
90.所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖40g/l、乙酸钠0.5g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、k2hpo4·
3h2o 2.0g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4 0.05 g/l、吐温-80 1.0ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.5g/l；
91.(3)冻干：将质量比为1:1的步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，冷冻干燥，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
92.其中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖120g/l、麦芽糊精40g/l、甘油30g/l和酵母细胞100g/l。
93.对比例1
94.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)种子培养基中的酵母蛋白胨替换为等质量浓度的牛肉膏蛋白胨、却将步骤(2)发酵培养基的酵母蛋白胨替换为等质量浓度的牛肉膏蛋白胨，其它制备方法与实施例1相同。
95.对比例2
96.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)种子培养基中的酵母浸粉替换为等质量浓度的牛肉浸粉、却将步骤(2)发酵培养基的酵母浸粉替换为等质量浓度的牛肉浸粉，其它制备方法与实施例1相同。
97.对比例3
98.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将鼠李糖乳杆菌lra05扩培两代后，就直接接种至含种子培养基的发酵罐中。
99.对比例4
100.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，培养至发酵液的od
600
为2.4，其它制备方法与实施例1相同。
101.对比例5
102.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述降温的过程中不添加氢氧化钠水溶液控制发酵液的ph，其它制备方法与实施例1相同。
103.对比例6
104.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.0，其它制备方法与实施例1相同。
105.对比例7
106.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述降温的过程中采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为6.5，其它制备方法与实施例1相同。
107.对比例8
108.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，长至对数生长期后期不降温，而直接在发酵12h后直接采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph，其它制备方法与实施例1相同。
109.对比例9
110.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述复合保护剂中不含海藻糖，麦芽糊精含量增至100g/l、甘油70g/l和酵母细胞140g/l，其它制备方法与实施例1相同。
111.对比例10
112.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述复合保护剂中不含麦芽糊精，海藻糖含量增至140g/l、甘油40g/l和酵母细胞110g/l，其它制备方法与实施例1相同。
113.对比例11
114.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步
骤(3)中，所述复合保护剂中不含甘油，海藻糖含量增至130g/l、麦芽糊精50g/l和酵母细胞110g/l，其它制备方法与实施例1相同。
115.对比例12
116.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述复合保护剂中不含酵母细胞，海藻糖含量增至160g/l、麦芽糊精70g/l和甘油60g/l，其它制备方法与实施例1相同。
117.对比例13
118.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将海藻糖替换为等质量浓度的乳糖，其它制备方法与实施例1相同。
119.对比例14
120.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将麦芽糊精替换为等质量浓度的蔗糖，其它制备方法与实施例1相同。
121.对比例15
122.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将甘油替换为等质量浓度的山梨醇，其它制备方法与实施例1相同。
123.对比例16
124.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将酵母细胞替换为等质量浓度的酵母粉，其它制备方法与实施例1相同。
125.对比例17
126.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用23wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.5，其他步骤与实施例1相同。
127.对比例18
128.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖110g/l、麦芽糊精50g/l、甘油20g/l和酵母细胞110g/l，其他步骤与实施例1相同。
129.对比例19
130.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖130g/l、麦芽糊精30g/l、甘油40g/l和酵母细胞90g/l，其他步骤与实施例1相同。
131.对比例20
132.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌泥和复合保护剂的质量比为0.5:1。
133.对比例21
134.本对比例提供一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌泥和复合保护剂的质量比为1.5:1。
135.试验例1
136.基本性能测试
137.测试样品：实施例1-4提供的产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉、对比例1-21提供的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
138.测试项目：
139.①
菌粉活菌数：依照gb4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验方法进行；
140.②
菌粉储存稳定性：
141.i.高温储存后的存活率：每组样品取10袋，分别测试放置前各组菌粉的活菌数记为活菌数0，同时测试在37℃、湿度为75
±
5％放置30d后活菌数记为活菌数1；其中，存活率(％)＝(经过储存后菌粉活菌数1/放置前的菌粉活菌数0)
×
100％，最后计算10袋的平均值；
142.ii.结块率：每组样品取10袋，分别测试放置前各组菌粉分别在40℃、湿度为75
±
5％的培养箱放置30d，分别过60目筛，计算结块率(％)＝留在筛网上的产品质量/产品总质量
×
100％，最后计算10袋的平均值；
143.③
菌粉分散溶解性：采用离心沉淀法测定上述样品的溶解性。
144.在10倍体积的蒸馏水中溶解质量为m的菌粉，然后1000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀物用gb5009.3-2010直接干燥法干燥后称质量得m2，并记录m1为已经恒质量过的称量皿质量，菌粉的溶解度根据下式计算。菌粉的溶解度(％)＝1-(m
2-m1)/m]
×
100％。
145.具体测试结果如下表1所示：
146.表1
[0147][0148]
由表1测试结果可知，本发明制备得到的冻干菌粉中活菌数可达到7000亿cfu/g以上，高温高湿下活菌数的存活率在65％以上，高温高湿下菌粉的结块率仅在10％以下，菌粉的溶解度在60％以上。由此说明，相对于对比例1-21提供的方法制备得到的冻干菌粉来说，使用本发明所述配方生产所得的冻干菌粉，
①
菌粉活菌数提高，
②
菌粉储存稳定性提高，
③
菌粉分散溶解性加强。
[0149]
试验例2
[0150]
抑菌能力测试
[0151]
测试样品：实施例1-4提供的产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉、对比例1-16提供的鼠李糖乳杆菌冻干粉；
[0152]
测试项目：使用琼脂扩散法进行抑菌试验：
[0153]
分别将上述各组所制得的菌粉按1
×
108cfu/ml，2％接种的3个不同的100ml的mrs液体培养基中，分别编号1～3，37℃培养12h。将发酵液10000g离心10min，去上清。1、2号上清用5m的naoh调整ph至6.5以排除酸影响。2号添加过氧化氢酶溶液(300u/ml，溶于pbs缓冲液)以排除过氧化氢的影响。3号用作对照(若2号为排除酸和过氧化氢的影响处理的，仍然产生抑菌圈，说明鼠李糖乳杆菌lra05产生了细菌素)。
[0154]
制备含有不同致病菌终浓度为1
×
106cfu/ml的平板，冷却凝固后用无菌打孔器在
平板上打8mm的孔，孔内分别加入100μl的1～3号发酵液上清，4℃扩散5h后37℃培养24h。最后量取抑菌圈直径，扣除8mm孔径的大小。
[0155]
其中，不同菌粉对具有5种常见的致病菌的抑制结果如下表2所示：
[0156]
表2
[0157][0158][0159]
其中，不同菌粉产细菌素的能力结果如下表3所示：
[0160]
表3
[0161]
[0162]
[0163][0164][0165]
由表2、3测试结果可知，本发明制备得到的冻干菌粉中对大肠杆菌的抑菌圈直径可达到11.3mm以上，对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径可达到13.4mm以上，对李斯特菌的抑
菌圈直径可达到18.25mm以上，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可达到15.25mm以上，对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径可达到14.3mm以上。由此说明，相对于对比例1-21提供的方法制备得到的冻干菌粉来说，使用本发明所述配方生产所得的冻干菌粉的菌体抗菌活性增强，且排除酸和过氧化氢的影响处理的，仍然产生抑菌圈，说明鼠李糖乳杆菌lra05产生了细菌素，而对比例1-21提供的方法制备得到的冻干菌粉无法产生细菌素或细菌素产率过少，酸和过氧化氢的影响处理抑菌圈直径过小。
[0166]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
技术特征：1.一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)种子培养：将鼠李糖乳杆菌lra05扩培三代后，再接种至含种子培养基的发酵罐中，培养至发酵液的od
600
≥2.5，得到种子液；其中，所述种子培养基的氮源包括酵母蛋白胨和酵母浸粉；(2)发酵培养：将步骤(1)得到的种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，进行培养，长至对数生长期后期降温，且所述降温的过程中控制发酵液的ph为5.8～6.0，离心收集，得到菌泥；其中，所述发酵培养基的氮源包括酵母蛋白胨和酵母浸粉；(3)冻干：将步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合，进行乳化，冷冻干燥，得到所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉；其中，所述菌泥和复合保护剂的质量比为(0.8-1.2):1，所述复合保护剂按质量浓度计包括：海藻糖115～125g/l、麦芽糊精35～45g/l、甘油25～35g/l和酵母细胞95～105g/l。2.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述鼠李糖乳杆菌lra05为鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus lra05菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.1.12734，保藏时间为2020年7月20日。3.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩培三代的具体步骤为：按接种量为1-3％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌lra05接种于种子培养基中，扩培至三代。4.根据权利要求3所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述扩培三代的具体参数为：一代于5～15ml的试管中36～38℃培养9～11h；二代于250～350ml锥形瓶中36～38℃培养9～11h；三代于2.5～3.5l锥形瓶中36～38℃培养5～7h。5.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养基包括：酵母蛋白胨8～12g/l、酵母浸粉8～12g/l、葡萄糖18～22g/l、乙酸钠0.4～0.6g/l、柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/l、k2hpo4
·
3h2o 1.8～2.2g/l、mgso4·
7h2o 0.05～0.2g/l、mnso
4 0.04～0.06g/l、吐温-80 0.8～1.2ml/l和半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6g/l。6.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养的具体步骤为：将鼠李糖乳杆菌lra05扩培三代后，再按接种量为1-3％的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中，于36～38℃下培养4～6h，培养至发酵液的od
600
≥2.5，得到种子液。7.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基包括：酵母蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖38-42g/l、乙酸钠0.4-0.6g/l、柠檬酸氢二铵1.8-2.2g/l、k2hpo4·
3h2o 1.8-2.2g/l、mgso4·
7h2o 0.05-0.2g/l、mnso4 0.04-0.06g/l、吐温-80 0.8-1.2ml/l、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.6g/l。8.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的具体步骤为：按接种量为1-3％的体积百分含量将种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中，于36～38℃培养10～12h后长至对数生长期后期后，再以0.3～0.5℃/
min的速率降温至25～28℃，且所述降温的过程中采用20-30wt％的氢氧化钠水溶液调节发酵液的ph为5.7～5.9。9.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心收集的温度为25～28℃，所述离心收集的转速为10000～14000rpm，所述离心收集的时间为150～180min。10.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-25℃，所述冷冻干燥的时间为36～40h。
技术总结本发明提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：(1)种子培养：将鼠李糖乳杆菌LRa05扩培三代后，再接种至含种子培养基的发酵罐中，培养至发酵液的OD
技术研发人员：方曙光 杨恒飞 程文 朱建国 严涛 陈珂可 蒋大成
受保护的技术使用者：微康益生菌（苏州）股份有限公司
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1
