1.本发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法。
背景技术：2.金叶斯蒂芬冬青属于常绿乔木，是美国乔治亚大学张冬林教授发现的内莉﹒斯蒂芬 冬青的芽变品种，亲本来源为英国冬青和中国枸骨的杂交种。叶片有光泽，深绿，前部 有刺，当年生枝和一年生枝新叶金黄或叶片边缘金黄。南京地区花期3月上旬至3月中 旬，果期4月至翌年2月，结果量大，果实成熟期晚，挂果时间长，国色鲜红亮丽，鸟 类冬季喜食，成年大树高6-8米，树冠自然呈圆锥形，冠幅可达4米，适宜作行道树、 庭园景观树，绿篱、圣诞树、盆景造型等，木质坚硬，宜做艺术品雕刻。
3.金叶斯蒂芬冬青适生区广，耐寒、耐旱、耐盐碱、耐贫瘠，是一种生态友好型树种， 可做蜜源和鸟类冬季食物。生长迅速，五年生苗木胸径可达6-8公分。耐修剪，宜苗木 造型；病虫害少，宜养护。雌雄同株，可自花授粉结实，果量大，色彩艳丽，干性强， 不倒伏。为丰富我国林木树种资源，满足市场需求，提出一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的 培育方法。
技术实现要素：4.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育 方法。
5.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
6.本发明提供了一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，包括以下步骤：
7.(1)初代培养：将处理好的冬青外植体苗在无菌条件下接种到初代培养基，在每 天2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周，获得诱导苗；
8.(2)继代培养：将所述诱导苗切段后放入继代培养基，诱导丛生芽进行继代培养， 在每天2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周，获得增殖苗；
9.(3)生根苗培养：在所述增殖苗中挑选高度2-4cm、继代周期35-40天的植株，切 割去基部愈伤及丛生芽，转入生根培养基，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度 23-25℃的环境中培养5周，获得生根苗；
10.(4)炼苗：将所述生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，以5％/d的速率降 低空气湿度至40％停止保持，以2500lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每 天照射14h，培养60d获得培育苗。
11.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中，在生根苗种植后7日起通入外 界环境空气，且早晚喷洒三氯杀螨砜和咪鲜胺各1500倍稀释液。
12.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)中冬青外植体苗的获得方法为：选 择无病虫害生长健壮的金叶斯蒂芬冬青嫩枝条作为外植体，进行前处理脱毒，处理完毕 后晾干备用。
13.作为本发明的进一步优化方案，所述前处理脱毒的过程为：将采集到的外植体切去 多余的叶片，并在流水下清洗干净，在超净工作台上，将外植体放入质量分数75％的乙 醇中浸泡30s，无菌水冲洗一次，再用质量分数0.1％的hgcl2浸泡6-15min，无菌水冲 洗3-4次，每次3min。
14.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)中初代培养基成分包括 wpm+ba0.3mg/l+iba0.1mg/l+kt0.1mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l。
15.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中继代培养基成分包括wpm +ba0.5mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l。
16.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)生根培养基成分包括1/2wpm +iba0.4mg/l+naa0.4 mg/l+糖20g/l+琼脂5g/l。
17.作为本发明的进一步优化方案，所述wpm培养基含有成分包括370mg/lmgso4、 950mg/lkso4、170mg/lkh2po4、400mg/lnh3no3、556mg/lca(no3)
2.
4h2o、72mg/ lcacl2、16.9mg/lmnso4、8.6mg/lznso4.7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.25mg/lna2moo4、0. 25mg/lcuso4.5h2o、37.3mg/lna
2-edta、27.8mg/lfeso4.7h2o、2mg/l甘氨酸、1.0m g/l盐酸硫胺素、0.5mg/l盐酸吡哆醇、0.5mg/l烟酸、100mg/l肌醇。
18.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)、(2)或(3)中培养基的ph＝5.8。
19.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中基质土由草炭土、珍珠岩、棉籽 粉按体积比3：1：0.2混合而成。
20.本发明的有益效果在于：本发明提供一种金叶斯蒂芬冬青的组培育苗培育方法， 由该方法制备得到的斯蒂芬冬青成活率高，生长周期短，遗传稳定性好，利于大规模推 广种植。
附图说明
21.图1是本发明金叶斯蒂芬冬青组培苗培育方法培育的处于诱导阶段的苗；
22.图2是本发明金叶斯蒂芬冬青组培苗培育方法培育的处于增殖阶段的苗；
23.图3是本发明金叶斯蒂芬冬青组培苗培育方法培育的处于生根阶段的苗。
具体实施方式
24.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施 方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域 的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
25.实施例1
26.本实施例中一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，包括以下步骤：
27.(1)初代培养：选择无病虫害生长健壮的金叶斯蒂芬冬青嫩枝条作为外植体，将 采集到的外植体切去多余的叶片，并在流水下清洗干净，在超净工作台上，将外植体放 入质量分数75％的乙醇中浸泡30s，无菌水冲洗一次，再用质量分数0.1％的hgcl2浸泡 6-15min，无菌水冲洗3-4次，每次3min，处理完毕后晾干备用，将处理好的冬青外植 体苗(注意切取伤口部分0.2-0.5cm)在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成 分包括wpm+ba0.3mg/l+iba0.1mg/l+kt0.1mg/l+白糖30g/l+琼脂6g/l，培养基的p h＝5.8，在每天
2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周，获得诱导苗，如图1所示；
28.(2)继代培养：将诱导苗切段后放入继代培养基，继代培养基成分包括wpm+ba0.5mg/l+白糖30g/l+琼脂6g/l，培养基的ph＝5.8，诱导丛生芽进行继代培养，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周，获得增殖苗，如图2所示；
29.(3)生根苗培养：在增殖苗中挑选高度2-4cm、继代周期35-40天的植株，切割去基部愈伤及丛生芽，转入生根培养基，生根培养基成分包括1/2wpm+iba0.4mg/l+naa0.4mg/l+白糖20g/l+琼脂5g/l，培养基的ph＝5.8，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度23-25℃的环境中培养5周，获得生根苗，如图3所示；
30.(4)炼苗：将生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，基质土由草炭土、珍珠岩、棉籽粉按体积比3：1：0.2混合而成，以5％/d的速率降低空气湿度至40％停止保持，以2500lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每天照射14h，培养60d获得培育苗。
31.wpm培养基含有成分包括370mg/lmgso4、950mg/lkso4、170mg/lkh2po4、400mg/lnh3no3、556mg/lca(no3)
2.
4h2o、72mg/lcacl2、16.9mg/lmnso4、8.6mg/lznso4.7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.25mg/lna2moo4、0.25mg/lcuso4.5h2o、37.3mg/lna
2-edta、27.8mg/lfeso4.7h2o、2mg/l甘氨酸、1.0mg/l盐酸硫胺素、0.5mg/l盐酸吡哆醇、0.5mg/l烟酸、100mg/l肌醇。
32.步骤(1)、(2)或(3)中培养基均通过高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃灭菌18min。
33.实施例2
34.(4)炼苗：将生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，基质土由草炭土、珍珠岩、棉籽粉按体积比3：1：0.2混合而成，在生根苗种植后7日起通入外界环境空气，且早晚喷洒三氯杀螨砜和咪鲜胺各1500倍稀释液，以5％/d的速率降低空气湿度至40％停止保持，以2500lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每天照射14h，培养60d获得培育苗。其余步骤同实施例1。
35.对比例1
36.(4)炼苗：将生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，基质土由草炭土、珍珠岩按体积比3：1混合而成，在生根苗种植后7日起通入外界环境空气，且早晚喷洒三氯杀螨砜和咪鲜胺各1500倍稀释液，以5％/d的速率降低空气湿度至40％停止保持，以2500lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每天照射14h，培养60d获得培育苗。其余步骤同实施例3。
37.对比例2
38.(4)炼苗：将生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，基质土由草炭土、珍珠岩、棉籽粉按体积比3：1：0.2混合而成，在生根苗种植后7日起通入外界环境空气，且早晚喷洒三氯杀螨砜和咪鲜胺各1500倍稀释液，以10％/d的速率降低空气湿度至40％停止保持，以5000lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每天照射14h，培养60d获得培育苗。其余步骤同实施例3。
39.对比例3
40.(4)炼苗：将生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，基质土由草炭土、珍珠岩按体积比3：1：0.2混合而成，空气湿度保持100％，以2500lux/d的光照强度照射14h，培养60d获得培育苗。其余步骤同实施例1。
41.将实施例1-2以及对比例1-3中培育的培育苗移植到自然环境。
42.成活率测试：观察实施例1-2以及对比例1-3所培育的培育苗各50株移植到自然环境 中后2个月时间的成活情况，记录成活率；
[0043][0044][0045]
从上表中可以看出，实施例1培育的组培苗移植到外部环境中成活率小于实施例2， 推测可能是实施例2对组培苗采取有抗病虫害措施，进一步增大冬青组培苗的成活率； 从对比例1和实施例1的成活率中可看出，对比例1相比较实施例1成活率低，推测原因可 能是棉籽粉有益于冬青的生长，有减少冬青染病的功能；通过对比例2、对比例3和实施 例的对比可看出，保持较高含量的湿度，相同的光照或者湿度降低速度过快，光照强度 增长过快都会导致冬青成活率降低。
[0046]
抗病虫害测试，选取移植到自然环境中一个月后存活的冬青苗，实施例1-2以及对 比例1-3所培育的培育苗各50株，接触红蜘蛛、蚜虫以及患褐叶病的冬青叶，记录15d后， 冬青苗的存活情况。
[0047]
项目实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3仅染褐叶病/％128181014仅染虫害/％6412412两者皆染/％14410214
[0048]
从上表中可以看出，实施例1的染病虫害数据大于实施例2和对比例2，推测可能是 实施例2对组培苗采取有抗病虫害措施，增加冬青苗的抗病虫害能力，又发现对比例1的 染病虫害数据，推测采用棉籽粉作为基质培养土可以减少冬青染病；通过对比例3和实 施例1的对比可看出，持续的良好的培养环境不利于冬青的抗病虫害。
[0049]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发 明的保护范围。
技术特征：1.一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)初代培养：将处理好的冬青外植体苗在无菌条件下接种到初代培养基，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周，获得诱导苗；(2)继代培养：将所述诱导苗切段后放入继代培养基，诱导丛生芽进行继代培养，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度25-27℃的环境中培养5周以上，获得增殖苗；(3)生根苗培养：在所述增殖苗中挑选高度2-4cm、继代周期35-40天的植株，切割去基部愈伤及丛生芽，转入生根培养基，在每天2500lux的光照强度照射14h且温度23-25℃的环境中培养5周，获得生根苗；(4)炼苗：将所述生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中，以5％/d的速率降低空气湿度至40％停止保持，以2500lux/d的速率增强光照强度至150000lux/d，且每天照射14h，培养60d获得培育苗。2.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在生根苗种植后7日起通入外界环境空气，且早晚喷洒三氯杀螨砜和咪鲜胺各1500倍稀释液。3.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中冬青外植体苗的获得方法为：选择无病虫害生长健壮的金叶斯蒂芬冬青嫩枝条作为外植体，进行前处理脱毒，处理完毕后晾干备用。4.根据权利要求3所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述前处理脱毒的过程为：将采集到的外植体切去多余的叶片，并在流水下清洗干净，在超净工作台上，将外植体放入质量分数75％的乙醇中浸泡30s，无菌水冲洗一次，再用质量分数0.1％的hgcl2浸泡6-15min，无菌水冲洗3-4次，每次3min。5.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中初代培养基成分包括wpm+ba0.3mg/l+iba0.1mg/l+kt0.1mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l。6.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(2)中继代培养基成分包括wpm+ba0.5mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l。7.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)生根培养基成分包括1/2wpm+iba0.4mg/l+naa0.4 mg/l+糖20g/l+琼脂5g/l。8.根据权利要求5-7任一所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述wpm培养基含有成分包括370mg/lmgso4、950mg/lkso4、170mg/lkh2po4、400mg/lnh3no3、556mg/lca(no3)
2.
4h2o、72mg/lcacl2、16.9mg/lmnso4、8.6mg/lznso4.7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.25mg/lna2moo4、0.25mg/lcuso4.5h2o、37.3mg/lna
2-edta、27.8mg/lfeso4.7h2o、2mg/l甘氨酸、1.0mg/l盐酸硫胺素、0.5mg/l盐酸吡哆醇、0.5mg/l烟酸、100mg/l肌醇。9.根据权利要求8所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)或(3)中培养基的ph＝5.8。10.根据权利要求1所述的一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)中基质土由草炭土、珍珠岩、棉籽粉按体积比3：1：0.2混合而成。
技术总结本发明涉及一种金叶斯蒂芬冬青组培苗的培育方法，属于植物培育技术领域，(1)初代培养：将处理好的冬青外植体苗在无菌条件下接种到初代培养基，培养获得诱导苗；(2)继代培养：将所述诱导苗切段后放入继代培养基，诱导丛生芽进行继代培养，培养获得增殖苗；(3)生根苗培养：在所述增殖苗中挑选高度2-4cm、继代周期35-40天的植株，切割去基部愈伤及丛生芽，转入生根培养基，培养获得生根苗；(4)炼苗：将所述生根苗取出通过基质土种植在105孔穴盘中培养60d获得培育苗。本发明提供一种金叶斯蒂芬冬青的组培育苗培育方法，由该方法制备得到的斯蒂芬冬青成活率高，生长周期短，遗传稳定性好，利于大规模推广种植。利于大规模推广种植。利于大规模推广种植。
技术研发人员：郝明灼 郭小芳 张敏 周鹏 邹义萍 梁有旺 卓涛 徐铭烨 陶文楷 黄亚健
受保护的技术使用者：江苏青好景观园艺有限公司
技术研发日：2022.06.14
技术公布日：2022/11/1
